發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 20:45

【摘要】：隨著工業(yè)快速發(fā)展,環(huán)境中鉛(Pb)、六價(jià)鉻(Cr(Ⅵ))含量急劇升高,對(duì)人類、動(dòng)植物和微生物均造成了大量毒害,因此,Pb、Cr(Ⅵ)毒性機(jī)制已在世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注。但是,目前關(guān)于Pb、Cr(Ⅵ)毒性機(jī)制研究主要集中在動(dòng)植物方面,關(guān)于Pb、Cr(Ⅵ)對(duì)微生物的毒性機(jī)制研究甚少。微生物在促進(jìn)物質(zhì)循環(huán),調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng),治理環(huán)境污染等方面起著重要作用,因此闡明Pb、Cr(Ⅵ)脅迫微生物的毒性機(jī)制,從而提出提高微生物對(duì)重金屬脅迫的耐受性和增強(qiáng)微生物對(duì)重金屬去除能力的具體措施,對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。因此,本研究以模式生物酵母細(xì)胞為研究對(duì)象,研究了Pb,Cr(Ⅵ)對(duì)酵母細(xì)胞的毒性作用和毒性機(jī)制;金屬硫蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)Pb,Cr(Ⅵ)毒性效應(yīng)的影響以及轉(zhuǎn)金屬硫蛋白(MT)酵母菌分別對(duì)電鍍廢水中Cr(Ⅵ)和含鉛廢水中Pb的去除效果。研究結(jié)果如下:1.濃度0~100 mg/L硝酸鉛可抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng),降低酵母細(xì)胞活性,誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡,隨著Pb濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng),酵母細(xì)胞死亡率逐漸增高,而泛caspase抑制劑Z-Asp-CH2-DCB可降低Pb誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡。同時(shí),Pb脅迫酵母細(xì)胞死亡過(guò)程中,胞內(nèi)活性氧(ROS)和Ca~(2+)水平顯著升高,線粒體膜電位顯著下降,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素c(cyt c)含量明顯增高;用1 mM抗壞血酸(AsA)可明顯降低Pb引發(fā)的酵母細(xì)胞死亡,0.5 mM鈣離子螯合劑EGTA或0.1 mM質(zhì)膜Ca~(2+)通道特異性抑制劑LaCl_3亦可明顯抑制Pb誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡。另外,加入AsA還能降低Pb處理組胞內(nèi)Ca~(2+)水平。結(jié)果表明Pb誘發(fā)酵母細(xì)胞死亡與胞內(nèi)ROS和Ca~(2+)水平升高有關(guān),ROS可介導(dǎo)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高,高濃度Ca~(2+)可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道開放,或者高水平ROS致線粒體膜損傷,導(dǎo)致線粒體膜電位下降,開放線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔并釋放cyt c,繼而激活相關(guān)下游信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一氧化氮(NO)作為生物體內(nèi)重要的內(nèi)源性信號(hào)分子,參與多種非生物脅迫響應(yīng),并在細(xì)胞死亡過(guò)程起著重要調(diào)節(jié)作用,為了闡明NO在Pb誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡中的作用,我們檢測(cè)了Pb對(duì)胞內(nèi)NO水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)Pb脅迫酵母細(xì)胞過(guò)程中,胞內(nèi)NO水平顯著升高。一氧化氮合酶抑制劑(L-name)和NO清除劑(cPTIO)能明顯緩解Pb對(duì)細(xì)胞毒性,而外源NO供體硝普鈉(SNP)能增加Pb對(duì)細(xì)胞毒性。為進(jìn)一步調(diào)查NO在Pb誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制,隨后我們檢測(cè)了胞內(nèi)一氧化氮對(duì)酵母細(xì)胞中Pb含量的影響。研究發(fā)現(xiàn),在Pb誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡過(guò)程中,L-name和cPTIO能明顯降低酵母細(xì)胞中的Pb含量。相反,SNP能提高酵母細(xì)胞中的Pb含量。基于這些研究,我們認(rèn)為NO可能通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)的Pb含量變化來(lái)調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞死亡。綜上所述,Pb誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡過(guò)程中,一方面通過(guò)誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS和Ca~(2+)水平升高,高濃度Ca~(2+)可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道開放,或者高水平ROS可能損傷線粒體膜,導(dǎo)致線粒體膜電位下降,cyt c釋放,繼而激活下游相關(guān)信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡;另一方面通過(guò)內(nèi)源性NO調(diào)節(jié)胞內(nèi)Pb含量變化誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡。2.濃度0~7 mM Cr(Ⅵ)可抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡,隨著Cr(Ⅵ)濃度提高和作用時(shí)間延長(zhǎng),酵母細(xì)胞死亡率逐漸增高。同時(shí),Cr(Ⅵ)脅迫酵母細(xì)胞死亡過(guò)程中,胞內(nèi)活性氧,鈣離子和一氧化氮水平明顯升高,線粒體膜電位明顯下降;用1 mM AsA或200 U CAT能明顯緩解Cr(Ⅵ)引發(fā)的酵母細(xì)胞死亡;0.5 mM鈣離子螯合劑EGTA或0.1 mM質(zhì)膜Ca~(2+)通道特異性抑制劑LaCl_3亦可明顯抑制Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡;0.2 mM cPTIO或1 mM L-name亦可明顯降低Cr(Ⅵ)引起的酵母細(xì)胞死亡。另外,加入cPTIO還能降低Cr(Ⅵ)處理組胞內(nèi)Ca~(2+)水平,而EGTA不能降低Cr(Ⅵ)處理組胞內(nèi)NO水平。結(jié)果表明Cr(Ⅵ)誘發(fā)酵母細(xì)胞死亡與處理組胞內(nèi)ROS、Ca~(2+)和NO升高有關(guān),NO可介導(dǎo)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高,高濃度Ca~(2+)可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道開放,導(dǎo)致線粒體膜電位下降,繼而損傷線粒體功能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。3.以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)金屬硫蛋白(MT)酵母菌為材料,研究MT在Pb和Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示,酵母經(jīng)相同濃度Pb或Cr(Ⅵ)處理后,轉(zhuǎn)MT酵母細(xì)胞死亡率顯著低于宿主菌。并且,用相同濃度Pb或Cr(Ⅵ)處理酵母細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MT酵母菌和宿主菌胞內(nèi)ROS,Ca~(2+)水平均有提高,但轉(zhuǎn)MT酵母胞內(nèi)ROS,Ca~(2+)水平顯著低于宿主菌,說(shuō)明MT可通過(guò)降低胞內(nèi)ROS和Ca~(2+)水平來(lái)緩解Pb和Cr(Ⅵ)對(duì)酵母細(xì)胞的毒性效應(yīng)。4.通過(guò)掃描電鏡和傅里葉變換紅外光譜對(duì)酵母菌的表面形態(tài),元素組成和物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,菌體光滑,表面積大,非常有利于對(duì)Cr(Ⅵ)的去除。通過(guò)分析結(jié)合Cr(Ⅵ)前后菌體的能譜圖,可知酵母菌表面結(jié)合了大量Cr(Ⅵ)。傅里葉變換紅外光譜研究顯示,在菌體去除Cr(Ⅵ)的過(guò)程中,主要參與的官能團(tuán)為羥基,氨基,磷酸基和酰胺基�？疾炝司w投加量、時(shí)間、pH、溫度及初始Cr(Ⅵ)濃度對(duì)轉(zhuǎn)MT酵母菌去除Cr(Ⅵ)的影響。研究發(fā)現(xiàn),菌體對(duì)Cr(Ⅵ)去除是一個(gè)快速過(guò)程,前15 min內(nèi)去除量快速增加,隨后增幅減緩,30 min后接近平衡;隨溶液pH增大,菌體對(duì)Cr(Ⅵ)去除量逐漸降低,pH=1.0時(shí),菌體對(duì)Cr(Ⅵ)去除量達(dá)到11.8 mg/g;在20℃~40℃內(nèi),菌體對(duì)Cr(Ⅵ)去除量隨溫度升高而增加;隨著菌體投加量增大,菌體對(duì)Cr(Ⅵ)的去除量逐漸降低,當(dāng)投加量為0.5 g/L時(shí),轉(zhuǎn)MT酵母菌對(duì)Cr(Ⅵ)去除量為8.01 mg/g;菌體投加量一定時(shí),菌體對(duì)Cr(Ⅵ)去除量隨溶液中初始Cr(Ⅵ)濃度升高而增大。等溫模型研究顯示,Langmuir和Freundlich都可以較為準(zhǔn)確的描述宿主菌和轉(zhuǎn)MT菌M1對(duì)Cr(Ⅵ)的去除行為。依據(jù)Langmuir等溫式,工程菌對(duì)Cr(Ⅵ)的最大去除量為8.27 mg/g,優(yōu)于宿主菌對(duì)Cr(Ⅵ)的最大去除量2.604 mg/g。通過(guò)對(duì)菌體去除Cr(Ⅵ)的過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)在轉(zhuǎn)MT酵母菌上的去除符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,擬合相關(guān)系數(shù)R~2為0.9691。響應(yīng)面分析及其等高線圖表明:pH、溫度及菌體投加量對(duì)Cr(Ⅵ)去除量線性效應(yīng)均顯著;pH與菌體投加量對(duì)Cr(Ⅵ)去除量的交互影響顯著。pH與溫度以及菌體投加量與溫度對(duì)Cr(Ⅵ)去除量的交互影響不顯著。通過(guò)求解二次回歸方程的最大值得到菌體對(duì)Cr(Ⅵ)的最優(yōu)去除條件為:pH 3.7,溫度29.5℃,菌體投加量為2.02 g/L,此時(shí),Cr(Ⅵ)去除量的預(yù)測(cè)值為6.49 mg/g。之后,根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的Cr(Ⅵ)最佳去除條件,用工程菌對(duì)北方集團(tuán)某電鍍車間含Cr(Ⅵ)電鍍廢水進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)通過(guò)三批次連續(xù)處理后,廢水中Cr(Ⅵ)含量低于國(guó)標(biāo)規(guī)定污水排放標(biāo)準(zhǔn)0.5 mg/L,實(shí)現(xiàn)了對(duì)電鍍廢水的凈化。5.利用轉(zhuǎn)MT酵母菌吸附Pb離子,考察了菌體投加量、時(shí)間、pH、溫度及初始Pb濃度對(duì)吸附效果的影響。研究發(fā)現(xiàn),菌體對(duì)Pb吸附過(guò)程較快,20 min接近平衡;工程菌對(duì)Pb的吸附量隨著pH上升,吸附量逐漸增加,pH=5時(shí),吸附量達(dá)到最高,隨后吸附量下降,逐漸趨于平緩。當(dāng)初始Pb濃度從10 mg/L提高到90 mg/L時(shí),M1菌對(duì)Pb吸附量從5.6 mg/g增加到48.3 mg/g;隨著菌體投加量增加,菌體對(duì)Pb吸附量呈下降趨勢(shì);當(dāng)溫度從20℃升高到40℃,M1菌對(duì)Pb吸附量從30.6 mg/g增加到37.2 mg/g;等溫模型研究顯示,Langmuir和Freundlich兩種模型都能很好描述轉(zhuǎn)MT菌吸附Pb的行為。依據(jù)Langmuir等溫式,工程菌對(duì)Pb最大吸附量為312.5 mg/g,優(yōu)于宿主菌對(duì)Pb最大吸附量125 mg/g。通過(guò)對(duì)菌體吸附Pb過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)Pb在轉(zhuǎn)MT菌上的吸附符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué),擬合相關(guān)系數(shù)R~2為0.9491。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X781.1;X172
【圖文】：

圖 1.1 2005-2009 中國(guó)鉛排放概況[17]Fig. 1.1 Pb emissions of China in 2005-2009及污染度最大的金屬元素，具有高度的耐腐蝕性，主要被應(yīng)用行業(yè)[18]。近年來(lái)，關(guān)于鉻污染的事件不斷發(fā)生。201水庫(kù)，危及數(shù)千萬(wàn)人飲水安全。2012 年，央視報(bào)道許；環(huán)境中的鉻污染主要來(lái)源于以下幾個(gè)方面。一，鉻每年排放的鉻渣約 40 萬(wàn)噸左右，鉻渣中含有大量鉻酸體和土壤[19]；二是不銹鋼、電鍍、制革等行業(yè)排放的業(yè)廢水中 Cr(Ⅵ)的排放量在 100 噸左右[21]；三是含鉻在土壤中大量累積[22]。

圖 1.1 2005-2009 中國(guó)鉛排放概況[17]Fig. 1.1 Pb emissions of China in 2005-2009染的金屬元素，具有高度的耐腐蝕性，主要被應(yīng)[18]。近年來(lái)，關(guān)于鉻污染的事件不斷發(fā)生。2，危及數(shù)千萬(wàn)人飲水安全。2012 年，央視報(bào)道境中的鉻污染主要來(lái)源于以下幾個(gè)方面。一，排放的鉻渣約 40 萬(wàn)噸左右，鉻渣中含有大量鉻土壤[19]；二是不銹鋼、電鍍、制革等行業(yè)排放水中 Cr(Ⅵ)的排放量在 100 噸左右[21]；三是含壤中大量累積[22]。

圖 2.1 鉛對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.2.1 Effects of Pb on cell growth in yeast酵母細(xì)胞死亡.2 所示，在 3～24 h 內(nèi)，酵母細(xì)胞死亡率與 Pb 濃越長(zhǎng)，死亡率越高；經(jīng) 2 mg/L 硝酸鉛作用 3 h 后顯差異，但在 24 h 后死亡率達(dá) 5.85%，明顯高于h 后死亡率為 33.81%，顯著高于對(duì)照組，表明 Pb和時(shí)間依賴性。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄒學(xué)敏;李梓民;楊雙波;李紫;吳成秋;;金屬硫蛋白對(duì)鉻染毒小鼠肝臟氧化損傷的修復(fù)作用[J];微量元素與健康研究;2013年06期

2 李雅;張?jiān)鰪?qiáng);沈鋒;;Fe~0修復(fù)重金屬鉻鉛復(fù)合污染水體的研究[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年03期

本文編號(hào)：2771266