【摘要】：常用于化學殺蟲劑的有機磷化合物,它可以破壞乙酰膽堿酯酶的活性,導致乙酰膽堿的堆積,從而引發(fā)一系列神經(jīng)中毒癥狀,甚至死亡。同時,有機磷農(nóng)藥的廣泛應用造成的環(huán)境污染也是不容忽視的。甲基對硫磷水解酶是一類可以破壞有機磷分子的磷酯鍵,最終使有機磷化合物毒性消失的酶。它屬于p內(nèi)酰胺酶家族,最適作用底物是甲基對硫磷。目前,關于這類酶功能和結(jié)構(gòu)方面的研究較少。因此,本研究就甲基對硫磷水解酶OPHC2耐熱性以及底物特異性與其結(jié)構(gòu)之間的關系進行了研究和探索。 甲基對硫磷水解酶OPHC2與同類酶相比,具有優(yōu)良的耐熱性。序列比對和三維結(jié)構(gòu)模型分析在該蛋白中存在兩個半胱氨酸(Cys110和Cys146),他們的硫原子之間的距離僅為2.03A,可能形成一個二硫鍵。還原條件下的SDS-PAGE電泳和DTNB滴定實驗結(jié)果都證實了這個二硫鍵確實存在。因此,為了探索這個二硫鍵是否與OPHC2的熱穩(wěn)定性相關,我們構(gòu)建了四個突變體C110L、C110A、C146A和C146M。通過酶學性質(zhì)比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個突變體的熱穩(wěn)定性都比OPHC2差,他們在60℃和70℃的半衰期只有原酶的50%。并且,內(nèi)源熒光光譜分析表明突變后酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,這些都說明了二硫鍵的存在對于維持OPHC2構(gòu)象穩(wěn)定性具有重要作用,它也是OPHC2具有良好熱穩(wěn)定的關鍵因素之一。 有機磷農(nóng)藥種類繁多,甲基對硫磷水解酶OPHC2對其中一些農(nóng)藥水解效果明顯,如甲基對硫磷、甲基對氧磷等。但是,對于一些其他底物(如對硫磷、對氧磷)水解能力較差,是什么因素影響了它的底物的選擇性,是否可以通過理性設計的突變獲得具有廣泛水解能力的甲基對硫磷水解酶是這部分研究的重點。我們采用了組合活性位點飽和實驗(CAST)的策略,選擇了五組氨基酸進行飽和突變,分別是A組(M188/M191),B組(L250/N251),C組(E168/F171),D組(E264/F265),E組(V55/L57)。通過篩選突變體庫,共得到了五株對乙基對硫磷水解能力提高的突變體,其中A1-5(M188L/M191S)和E-6(L57V)最好,再將這兩個突變體的突變位點進行組合突變,最終獲得突變體AE (M188L/M191S/L57V)。將這三個突變基因轉(zhuǎn)入酵母表達系統(tǒng)進行表達,測定重組酶酶學性質(zhì),結(jié)果表明A1-5、E6和AE重組酶對乙基對硫磷的水解能力(kcat/Km)分別是OPHC2的2.7倍、3.3倍和4.2倍。經(jīng)過軟件模擬及比較OPHC2和突變酶結(jié)構(gòu),推測第57位、第188位和第191位的氨基酸突變后使酶蛋白與底物結(jié)合口袋空間增大,更利于酶蛋白結(jié)合和催化側(cè)鏈集團較大的乙基對硫磷。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士后
【學位授予年份】：2010
【分類號】：X172

【參考文獻】

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本文編號：2771013