【摘要】：地下深部、酸性礦坑排水、熱泉、以及高鹽等極端環(huán)境往往棲息著很多微生物,極端環(huán)境微生物是地球生物圈的重要組成部分。這些極端環(huán)境有的含有高濃度砷;但是,至目前為止,對這些極端環(huán)境高砷沉積物中廣泛存在的砷氧化菌還知之甚少,對這些微生物的多樣性與活性特征、及其介導(dǎo)的砷的生物地球化學過程還未見報道。本論文以典型高砷地下水區(qū)域地下深部高砷沉積物、雄黃尾礦酸性礦坑排水高砷土壤、熱泉高砷沉積物等三個代表性的極端環(huán)境砷氧化微生物為研究對象,較系統(tǒng)地分析了微生物群落和砷氧化酶基因的多樣性特征、砷氧化微生物的功能、以及砷氧化微生物對礦物砷溶解和釋放的影響,揭示了極端環(huán)境條件下砷氧化微生物在砷的生物地球化學循環(huán)中所起的作用、及其對高砷地下水形成的影響,為砷污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供依據(jù)。地下深部高砷沉積物砷氧化微生物多樣性、活性特征及其對砷釋放的影響。地球化學分析結(jié)果表明,地下深部高砷沉積物含高濃度的總砷(6.74-27.90 mg/kg)、TOC(0.27-8.37 g/kg),相對較高濃度的SO_4~(2-)(14.53-863.87 mg/kg)、NH_4~+(3.12-52.77g/kg)、Cl~-(3.88-511.76 mg/kg)、Fe(12.13-62.50 g/kg),以及相對較低濃度的NO_3~-(0.23-3.03 mg/kg)、Ca(6.80-32.34 g/kg)、Mg(2.33-12.22 g/kg);采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù),分析了樣品的微生物群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)高砷沉積物樣品含有的微生物隸屬于31個門,其中占優(yōu)勢的微生物有Firmicutes(63.20%)、Proteobacteria(24.77%)和Actinobacteria(6.88%);微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明,對微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大的環(huán)境因子有Cu(R~2=0.9564,P=0.075)、Sb(R~2=0.9088,P=0.018)、Al(R~2=0.8969,P=0.033)、TON(R~2=0.7358,P=0.017)、K(R~2=0.7355,P=0.023)、以及Fe(R~2=0.6314,P=0.078);另外,Fe與Al、Cu、Sb、K、TON呈正相關(guān),與TOC成負相關(guān);TOC對沉積物深度為1 m、114 m、223 m和200 m樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大,對深度為30 m、65 m、95 m、175 m和145 m的樣品微生物群落結(jié)構(gòu)影響較小。高砷沉積物樣品微生物催化砷氧化的microcosm實驗表明,所有9個高砷沉積物樣品中的微生物既能利用有機碳源、又能利用無機碳源;當反應(yīng)體系添加0.2%酵母提取物或10.0 mM NaHCO_3為外加碳源時,樣品微生物能分別在48-95小時和72-288小時內(nèi)將1.0 mM As(III)完全氧化。地下深部高砷沉積物樣品微生物群落砷氧化酶催化亞基AioA的基因序列的生物信息學分析表明,共獲得了98條新的AioA蛋白序列,包括由11個新的AioA組成的砷氧化酶新家族,進化位置介于β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria之間;由10個新的AioA組成的3個砷氧化酶新亞家族,三個新亞家族分別屬于β-Proteobacteria、β-Proteobacteria、α-Proteobacteria;以及其余76個新的AioA蛋白,分別屬于ε-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、β-Proteobacteria、α-Proteobacteria AioA。這些aioA基因序列與已知的細菌界和古菌界微生物的同源性為34-99%。以上結(jié)果表明,地下深部高砷沉積物中含有的砷氧化微生物均為新的未報道的砷氧化微生物。地下深部高砷沉積物微生物群落砷釋放結(jié)果表明,高砷沉積物中的微生物在有氧條件下,明顯促進了沉積物中的不溶性砷的溶解和釋放;微生物作用28天后,114 m樣品釋放的砷濃度最高,為10.78μM,其次是65 m樣品,釋放的砷濃度為4.69μM,其它樣品釋放的砷濃度從高到低依次是:95 m(3.48μM)、200 m(3.19μM)、135 m(2.89μM)、175 m(2.01)、223 m(1.60μM)、30 m(1.41μM)、和1 m(0.52μM)。微生物催化的砷釋放濃度隨著時間的變化,或增高,或降低,表明反應(yīng)體系中發(fā)生了微生物介導(dǎo)的砷溶解和砷吸附等過程。酸性礦坑排水高砷沉積物砷氧化微生物多樣性、活性特征及其對砷釋放的影響。地球化學結(jié)果表明,與其它已報道的酸性沉積物相比,酸性礦坑排水高砷沉積物含較高濃度的總砷(973.54-13387 mg/kg),相對較低的TOC(4.3-5.1 g/kg),相對較高的SO_4~(2-)(1240-60680 mg/kg)。酸性礦坑排水高砷沉積物微生物群落有細菌24個門,占優(yōu)勢的微生物為Firmicutes(86.29%)、Proteobacteria(11.89%)。酸性礦坑排水高砷沉積物中微生物群落催化砷氧化的microcosm結(jié)果表明,3個高砷沉積物樣品既能利用有機碳源又能利用無機碳源進行氧化。當以0.2%酵母提取物或10mM NaHCO_3為外加碳源時,沉積物能分別在48-72小時、48小時將外源1 mM As(III)完全氧化。酸性礦坑排水高砷沉積物中微生物群落的砷氧化酶催化亞基AioA的基因序列的生物信息學分析表明,共獲得了31條新的AioA酶,包括由1個新的AioA組成的砷氧化酶新家族,進化位置介于α-Proteobacteria和Archeae之間;由2個新的AioA組成的2個砷氧化酶新亞家族,兩個新亞家族分別屬于β-Proteobacteria和α-Proteobacteria;以及其余29個屬于β-Proteobacteria、α-Proteobacteria的新成員。這些aioA基因序列與已知的細菌界和古菌界微生物的同源性為42-95%。酸性礦坑排水高砷沉積物在好氧狀態(tài)下微生物群落砷釋放結(jié)果表明,高砷沉積物中的微生物在有氧條件下,明顯促進了沉積物中的不溶性砷的溶解和釋放;微生物作用28天后,沉積物T4釋放的砷濃度最高,達152.22μM,其次為沉積物T1B(118.20μM)、T4(158.08μM)。熱泉高砷沉積物砷氧化微生物多樣性、活性特征及其對砷釋放的影響。地球化學結(jié)果表明,熱泉高砷沉積物其它已報道的熱泉沉積物相比,含較高濃度的總砷(8.64 mg/kg),相對較高的TOC(34 g/kg)。熱泉高砷沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)有7個不同的細菌門類。其中,最豐富的是Proteobacteria(54.46%)、Firmicutes(31.68%)、Bacteroidetes(4.46%)、Chloroflexi(3.96%)。熱泉高砷沉積物微生物群落催化砷氧化的microcosm結(jié)果表明,熱泉高砷沉積物樣品既能利用有機碳源又能利用無機碳源進行氧化。當以0.2%酵母提取物、10 mM NaHCO_3、10.0 mM葡萄糖、10.0 mM乳酸為外加碳源時,熱泉高砷沉積物能分別在216小時、264小時、120小時、120小時內(nèi)將外源1 mM As(III)完全氧化。但是熱泉沉積物微生物群落并非能利用所有碳源,當添加10.0 mM乙酸作為唯一碳源時,其氧化效率與不添加沉積物的對照組一致。熱泉高砷沉積物中微生物群落的砷氧化酶催化亞基AioA基因序列的生物信息學分析表明,熱泉高砷沉積物微生物群落共獲得了20條新的AioA蛋白,包括由1個新的AioA組成的砷氧化酶新家族,進化位置介于β-Proteobacteria和Archeae之間;由1個新的AioA組成的1個β-Proteobacteria砷氧化酶新亞家族;以及其余18個屬于β-Proteobacteria、α-Proteobacteria的新成員。這些aioA基因序列與已知的細菌界和古菌界微生物的同源性為44-93%。此外,分離到1株嗜熱砷氧化微生物GHS311。GHS311在30℃或65℃下完全不生長;在45℃下,菌株GHS311才得到最適生長。編碼嗜熱菌株GHS311亞砷酸鹽氧化酶大催化亞基AioA的基因與其它已知可培養(yǎng)單株AioA序列同源性為84.7%-57.6%,有趣的是,這6個單株均為非嗜熱單株。熱泉高砷沉積物在好氧狀態(tài)下微生物群落砷釋放結(jié)果表明,高砷沉積物中的微生物在有氧條件下,明顯促進了沉積物中的不溶性砷的溶解和釋放;微生物作用28天后,添加10 mM NaHCO_3的實驗組砷最高釋放濃度為5.79μM,添加0.2%酵母提取物實驗組最高砷釋放濃度為3.09μM。此外,篩選到了地下深部23株可培養(yǎng)砷氧化微生物,分別來自α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes。砷氧化活性檢測后,發(fā)現(xiàn)有9株菌表現(xiàn)出了較強的砷氧化能力,7株為自養(yǎng)型,2株為異養(yǎng)型�；茏责B(yǎng)砷氧化微生物和異養(yǎng)型砷氧化微生物能分別在14-60小時、34-60小時之內(nèi)將1 mM As(III)完全氧化。最終成功擴增、克隆了7株菌的砷氧化酶,其砷氧化酶分別屬于α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria的AioA家族,最大同源性為79%-99%。有兩株微生物(Pseudorhodoferax sp.N105-12和Shinella sp.N114-3)的aioA基因發(fā)生了水平基因轉(zhuǎn)移。砷氧化微生物對含砷礦物(毒砂)砷釋放的結(jié)果表明,有氧狀態(tài)下,砷氧化微生物可促進或抑制毒砂的砷釋放,但不同微生物促進/抑制砷釋放程度完全不同。微生物作用28天后,菌株N105-5和N105-12對毒砂砷釋放的最高抑制濃度分別為13.8μM、12.4μM;菌株N105-16、N114-3、N125-8、N125-10在一定時間內(nèi),對毒砂的促進濃度分別為9.3μM、5.9μM、4.1μM、6.5μM。最后,比較分析了這三種極端環(huán)境高砷沉積物砷氧化微生物多樣性、活性特征及其對砷釋放的影響。結(jié)果表明,酸性礦坑排水沉積物總砷含量(973.54-13387mg/kg)最高,熱泉沉積物TOC含量(34 g/kg)最高。微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性表明地下深部高砷沉積物所含門類(31個)最多,其次為酸性礦坑排水高砷沉積物(24個)、熱泉高砷沉積物(7個)。微生物群落催化砷氧化能力由大至小依次為酸性礦坑排水高砷沉積物、地下深部高砷沉積物、熱泉高砷沉積物。功能酶基因aioA在相應(yīng)微生物群落中多樣性由高至低依次為地下深部高砷沉積物、酸性礦坑排水高砷沉積物和熱泉高砷沉積物。沉積物樣品微生物群落砷釋放最高濃度由高至低依次為酸性礦坑排水高砷沉積物、地下深部高砷沉積物和熱泉高砷沉積物。
【學位授予單位】：中國地質(zhì)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X172
【圖文】：

經(jīng)鉻砷酸銅處理的木材的加工；⑦在部分東歐地區(qū)的前軍事基地里，化學武器乙烯基二氯胂、二苯氯胂、苯氯乙酮的生產(chǎn)和儲存而導(dǎo)致的嚴重污染; ⑧農(nóng)業(yè)砷試劑的大量使用，如有機砷化合物洛克沙胂(4 -羥基-3 -硝基苯基胂酸)；⑨過程等。.1.2 砷的分布及含量伴隨著天然過程和人類活動兩種方式，砷對環(huán)境造成了嚴重的污染。陸地上的豐度平均為 1.5-3 mg/kg。(1) 地下水是最多，也是最主要的易被人類接觸到砷的一種方式。目前，全很有地方受高砷地下水的污染(圖 1.1)[15]。被研究相對深入的高砷地下水區(qū)域]有孟加拉、孟加拉邦、中國(臺灣、內(nèi)蒙古、山西)、阿根廷(Chaco-Pampean 平原利北部、泰國(Ron Phibun)等地，其地下水砷濃度分別為 0.5-2500 μg/L、1-3g/L、10-1820 μg/L、1-2400 ug/L、1-3050 μg/L、1-5300 μg/L、100-1000 μg/L、000 ug/L 等。此外，高砷沉積物中也發(fā)現(xiàn)了砷的存在，主要來源礦物砷的釋放

圖 1.2 原核微生物砷代謝途徑[71]微生物對砷的攝取、沉淀及排出酸鹽與磷酸鹽結(jié)構(gòu)類似，主要通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[71]進入革蘭氏陰性細磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)介導(dǎo)了此過程：結(jié)構(gòu)型的 Pit 和誘導(dǎo)性的 Pst。一般主要 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入細胞，只有在環(huán)境中磷酸鹽水平較低時，才會大量通過 Pst進入細胞[72]。砷酸鹽與甘油結(jié)構(gòu)類似，在 pH 小于 9.3 時，以不帶電荷的 As(OH)3形式此大部分亞砷酸鹽通過水-甘油跨膜轉(zhuǎn)運通道進入細胞[73-75]。原核生物大scherichiacoli)GlpF 的突變體保留了對 As(III)的敏感性，因此，有 1-2 個s(III)攝取系統(tǒng)，比如 ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，有助于 As(III)的攝取。砷可能對細胞造成毒性前，微生物通過胞外沉淀(Extracellularprecipitatiohelation)、細胞內(nèi)隔離(Intracellularsequestration)、外排系統(tǒng)(Activeextrushe cell)來降低砷對細胞的傷害[76]。

正因為有了微生物的關(guān)鍵作用，才使得砷的地球化學循環(huán)成為可能[微生物催化的砷的生物地球化學循環(huán)過程如下(圖 1.3)：①各種具備生物厭氧砷還原的微生物將 As(V)還原成 As(III)[137-138]。其中厭氧砷還原微生物了富 As(V)沉積物中 As(V)向 As(III)的轉(zhuǎn)化，由于 As(III)易遷移的特性，同地下水和/或土壤造成了污染[139]。②As(III)反過來，又被亞砷酸鹽氧化微生成 As(V)。As(III)的氧化可導(dǎo)致海洋沉積物/淡水沉積物中的礦物對 As(V)的吸附[140]。As(III)同時也可被依賴亞砷酸鹽的不產(chǎn)氧光合作用氧化[141]。③無可以轉(zhuǎn)化成甲基砷進行解毒。甲基化的砷以揮發(fā)性的甲基胂形式存在，主A(III)，以及少量 MMA(III)和 DMA(III)[142]。④甲基砷也可以去甲基化成無-145]，與③形成雙向循環(huán)，目前在很多環(huán)境中都有發(fā)現(xiàn)[146-158]。比如人為用劑和殺蟲劑等[159-160]的有機砷化合物如 MAs(V)和洛克沙砷，可在環(huán)境中微用下去甲基化成無機砷。⑤海水中砷的主要形式為 As(V)，它可被藻類轉(zhuǎn)化[161]。⑥在很多生物體中都發(fā)現(xiàn)了砷累積現(xiàn)象。如蕨類植物在其地面以上組超富集砷[162-163]，水稻植物不僅可以不僅可以吸收無機砷而且可以將其甲基終在谷粒中累積[164]，海洋動物可以累積砷糖及砷甜菜堿等[165]。

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