發(fā)布時間：2020-07-15 01:32

【摘要】：多氯聯(lián)苯（Polychlorinated Biphenyls，PCBs）是一類人工合成的環(huán)境異源物質(zhì)，由于其在環(huán)境中難降解性及具有生物富集性，已被《關(guān)于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》列為12種持久性有機污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）之一。PCBs雖已被禁止生產(chǎn)，但已造成“全球性的環(huán)境污染”。PCBs的植物修復(fù)技術(shù)，具有低成本、應(yīng)用性強、對環(huán)境友好、可最大程度保持土壤基本性質(zhì)不變等特點，是最具有應(yīng)用前景的修復(fù)技術(shù)。但是植物修復(fù)技術(shù)受PCBs對植物生長毒害作用及土壤中PCBs生物可利用性低等因素的限制，在實際場地修復(fù)中，效果往往達不到預(yù)期。因此，本研究擬利用轉(zhuǎn)bphC苜蓿聯(lián)合乳化蛋白AlnA修復(fù)PCBs污染的土壤，研究轉(zhuǎn)基因苜蓿對PCBs的耐受性；分析AlnA能否提高PCBs的生物可利用性；闡明轉(zhuǎn)基因苜蓿-乳化蛋白AlnA聯(lián)合修復(fù)PCBs污染的土壤效能。 （1）亞克隆來源于土壤宏基因組的2,3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因（bphC），構(gòu)建其植物表達載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，遺傳轉(zhuǎn)化于苜蓿，通過草胺膦的抗性篩選，獲得了10株苜蓿轉(zhuǎn)化株系。并采用無性繁殖的方法進行擴繁，用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因株系的鑒定研究。通過PCR方法和western blot等分子生物技術(shù)檢測苜蓿轉(zhuǎn)化株系，結(jié)果表明bphC基因已經(jīng)整合進入6株轉(zhuǎn)基因苜蓿株系，并在植株體內(nèi)表達。 （2）通過對聯(lián)苯的抗性篩選、轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)bphC酶活檢測，確定轉(zhuǎn)基因苜蓿株系BB11對PCBs的耐受性最強。采用水培法，研究轉(zhuǎn)基因苜蓿對混合PCBs的耐受性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)bphC苜蓿對混合PCBs的耐受指數(shù)為88%，與野生型苜蓿（僅為54%）相比，提高了34%。通過比較分析轉(zhuǎn)基因和野生型苜蓿體內(nèi)PCBs含量研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因苜蓿和野生型苜蓿都能吸收和輸導(dǎo)PCBs，但是轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)PCBs含量顯著低于野生型苜蓿，說明轉(zhuǎn)基因苜蓿對PCBs降解效率顯著高于野生型苜蓿。因此，在后續(xù)的實驗中以轉(zhuǎn)bphC苜蓿BB11作為實驗材料。 （3）從抗輻射不動桿菌（Acinetobacter radioresistens）中克隆AlnA基因，構(gòu)建原核表達載體，在IPTG誘導(dǎo)下，AlnA蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達，通過鎳柱純化和western blot奠定，獲得純化的AlnA蛋白。AlnA蛋白具有表面活性，CMC值為1.07g/L (≈0.03mM)。 AlnA蛋白對不同氯原子數(shù)取代PCBs同系物都具有增溶活性，其中對四氯代的PCB52增溶活性最強。乳化蛋白AlnA雖能吸附于土壤，但是對土壤中的PCBs具有較強的解吸能力，其解吸能力與氯原子的取代數(shù)目沒有相關(guān)性，對四氯代PCB52的解吸效率達74%。并且AlnA蛋白能促進苜蓿吸收土壤中的PCBs， AlnA蛋白的添加量與植物組織中PCBs的濃度成正相關(guān)。苜蓿不僅能吸收PCBs，也能將PCBs運送到地上部分，其中PCB28在苜蓿地上部分的濃度最高，說明苜蓿對其運輸能力最強。 通過3D建模和分子拼接的方法，研究AlnA蛋白對PCB同系物的增溶機制。根據(jù)分子對接和溶解活性研究結(jié)果分析，AlnA蛋白對PCBs的溶解機制與結(jié)合能，結(jié)合簇及能量構(gòu)象密切相關(guān)。AlnA蛋白為非特異性的生物表面活性劑，PCBs可與AlnA蛋白不同結(jié)合位點結(jié)合，形成多重構(gòu)象。利用盲目對接手冊研究表明：高氯代的PCBs（PCB28,52和101）與AlnA蛋白有較強的親和力。7種PCBs同系物都與AlnA蛋白具有典型的β-桶狀結(jié)構(gòu)結(jié)合。不同的PCB同系物與AlnA蛋白之間存在著不同的結(jié)合位點，這也受到PCBs分子的空間位阻和電子云分布的影響。 （4）利用盆栽實驗，研究轉(zhuǎn)bphC基因苜蓿聯(lián)合乳化蛋白AlnA對PCBs污染土壤的修復(fù)效能。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)bphC基因苜蓿-乳化蛋白AlnA聯(lián)合修復(fù)PCBs污染土壤的效能最高。轉(zhuǎn)基因苜蓿的株高、鮮重及葉片的葉綠素（B處理）含量等生理指標均高于野生型苜蓿，表明轉(zhuǎn)基因苜蓿對PCBs的耐受性顯著高于野生型苜蓿；但是當添加AlnA乳化蛋白，轉(zhuǎn)基因苜蓿的生理指標與野生型苜蓿相當，說明轉(zhuǎn)基因苜蓿的生長受到抑制。這可能是乳化蛋白AlnA提高了土壤中PCBs的生物可利用性，使轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)的PCBs含量顯著提高（A處理），進而對其生長產(chǎn)生一定的抑制作用。 在PCBs的脅迫下，不同處理中土壤酶活性差異顯著，而且與未栽培苜蓿的對照相比，苜蓿的栽培可顯著提高土壤中的脫氫酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶的活性。尤其是只種植轉(zhuǎn)基因苜蓿（B）處理中土壤的這三種酶的活性最強，說明植物的生長性狀與土壤微生物的活性密切相關(guān)。土壤中PCBs降解基因bphC豐度研究結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因苜蓿與乳化蛋白AlnA聯(lián)合修復(fù)PCBs污染土壤效能的提高，與PCBs降解基因豐度的增強密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X53
【圖文】：

汁絲孢酵母（Trichosporon mucoides）和釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）；白腐菌有黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium），Phlebia brevispoTMIC33929 ，糙皮側(cè)耳（ Pleurotus ostreatus ），朱紅密孔菌（ Pycnoporcinnabarinus）和粗毛栓菌（Tramete sversicolor），還有外生菌根真菌（Gautiercrispa），灰樹花（Grifola frondosa），菌根真菌（Radiigera atrogleba）和尖端賽多孢子菌（Scedosporium apiospermum）等真菌。與細菌降解相比，真菌降解途徑具有很多優(yōu)點。真菌降解系統(tǒng)是由自由基攻擊介導(dǎo)，具有較低特異性，并且這個反應(yīng)是在真菌胞外完成。因此真菌降解系統(tǒng)能降解底物范圍寬泛的芳烴化合物。另外，一些真菌菌株與植物的根之間具有共生關(guān)系，形成內(nèi)生菌根和外生菌根；這種共生關(guān)系促進了真菌的生長，使它們抗性增強（Donnelly & Fletcher，1995）。但是真菌對 PCBs 比較敏感，不能耐受高濃度的 PCBs，初始的 PCBs 濃度越高可能會導(dǎo)致對其降解能力下降（Murado et al., 2002；Ruiz-Aguilar et a2002 ；Field et al., 2008；Hickey, 1996； Ruiz-Aguilar et al., 2002）。

又將最后反應(yīng)一步分為兩個獨立的階段，一是只將產(chǎn)物局限于運中，而第二步是最終反應(yīng)（與細胞壁結(jié)合或排泄）（Theodoulor, 2007）。物代謝 PCBs 一般形成水溶性更強的羥基氯代聯(lián)苯（Mackova et a et al.，1995；Kuˇcerová et al.，2000；Rezek et al.，2009）。不同實明植物細胞能將一氯代和二氯代 PCB 羥基化，但是也有特例，同苯的 4,4′-二氯代聯(lián)苯卻不能被羥基化，可能是有由于結(jié)構(gòu)保護作酶的進攻，而 2,4,4′-三氯代聯(lián)苯卻可以被羥基化（Kuˇcerová et a et al.，2003；Harms et al.，2003）。進一步研究發(fā)現(xiàn)植物細胞能代的二氯、三氯和四氯代同系物，Harms 等（2003）報道 3,3′,4,4′-薔薇科和萵苣氧化成單羥基的中間代謝產(chǎn)物。同樣 2,2′,5,5′-四氯 3,4-二羥基-2,2′,5,5′-四氯代聯(lián)苯。

因此，轉(zhuǎn)基因植物分泌的解毒酶有利于根際修復(fù)更廣泛的疏水化學(xué)物質(zhì)。提高轉(zhuǎn)基因植物的根際修復(fù)可能是 PCBs 污染原位修復(fù)有效方法之一。圖1.3 根際區(qū)域與修復(fù)效能相關(guān)的酶和微生物活動示意圖（Abhilashetal.,2009）Fig. 1.3 Schematic representation of the enzymatic and microbial activities responsiblefor the enhanced remediation in rhizospheric zone（Abhilash et al., 2009）.1.2.4.4 加入表面活性劑現(xiàn)已公認，生物可利用性是限制 PCBs 生物修復(fù)的重要因素之一。在受污染18

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 余剛,黃俊,張彭義;持久性有機污染物:倍受關(guān)注的全球性環(huán)境問題[J];環(huán)境保護;2001年04期

2 滕應(yīng);李秀芬;潘澄;馬文亭;宋靜;劉五星;李振高;吳龍華;陳夢舫;駱永明;;土壤及場地持久性有機污染的生物修復(fù)技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用[J];環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù);2011年03期

3 滕應(yīng);鄭茂坤;駱永明;高軍;李振高;吳龍華;;長江三角洲典型地區(qū)農(nóng)田土壤多氯聯(lián)苯空間分布特征[J];環(huán)境科學(xué);2008年12期

4 崔力拓;李志偉;;紫花苜蓿-菌根真菌-根瘤菌對多氯聯(lián)苯污染土壤的修復(fù)作用[J];農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報;2008年01期

5 彭偉;譙華;方振東;郝全龍;張楷;余海波;;多氯聯(lián)苯污染土壤修復(fù)技術(shù)研究進展[J];化學(xué)與生物工程;2014年06期

6 姚艷玲;崔海瑞;盧美貞;金基強;;Cry1Ab蛋白在不同土壤中的吸附與解吸[J];土壤學(xué)報;2007年02期

7 張雪蓮;駱永明;滕應(yīng);俞元春;王家嘉;徐莉;李振高;;長江三角洲某電子垃圾拆解區(qū)土壤中多氯聯(lián)苯的殘留特征[J];土壤;2009年04期

本文編號：2755775