【摘要】：污染的空氣和水體中存在多種化學(xué)致癌物,如苯并芘、黃曲霉毒素、有機(jī)氯、磷農(nóng)藥和亞硝胺等,這些環(huán)境污染物會誘導(dǎo)DNA損傷,對細(xì)胞的生存和生長產(chǎn)生影響,甚至誘發(fā)各種腫瘤。而來源于燃料燃燒的煙氣則是空氣污染的主要原因之一,例如汽車尾氣、垃圾焚燒煙氣、火災(zāi)煙氣、烹調(diào)煙氣等。煙氣成分復(fù)雜,因燃料的種類、燃燒方式而異,危害性也與顆粒成分和大小有關(guān)。有害煙氣短期大劑量暴露會造成急性中毒,而長期低劑量暴露對人體健康的影響是廣泛的,往往和DNA損傷和修復(fù)、細(xì)胞氧化應(yīng)急、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等有相關(guān)性,有的還會影響神經(jīng)系統(tǒng),但這種危害不容易防范,往往會被人們所忽略。因此,對環(huán)境煙氣進(jìn)行危害識別、發(fā)展降低煙氣危害的有效方法、增強(qiáng)人們的防護(hù)意識,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。卷煙煙氣是一種典型的環(huán)境煙氣,目前在已經(jīng)鑒定出的約4800多種化學(xué)物質(zhì)中就有69種已被確定為致癌物,部分化合物屬于腫瘤促進(jìn)因子或輔助致癌物,例如煙堿、CO、HCN、煙草特有亞硝胺等。相對于其他來源的煙氣例如烹飪產(chǎn)生的油煙氣、垃圾焚燒等產(chǎn)生的混合氣溶膠形式的污染物來說,卷煙煙氣總粒相物(Total Particulate Matter,TPM)具有釋放穩(wěn)定,有害化學(xué)物質(zhì)明確、捕集方法科學(xué)規(guī)范、樣品來源便捷、容易控制、可反復(fù)試驗(yàn)、長期低劑量暴露等顯著優(yōu)勢。因此,本論文將卷煙煙氣總粒相物作為環(huán)境煙氣的模式樣品,研究如何高通量篩查煙氣誘導(dǎo)的遺傳損傷以及如何運(yùn)用化學(xué)防護(hù)劑的方法來有效抵抗煙氣危害,最后從轉(zhuǎn)錄組和蛋白水平探討防護(hù)機(jī)制。本論文內(nèi)容分為三部分:第一部分是研究建立TPM誘導(dǎo)DNA損傷的三類高通量篩查方法,為環(huán)境煙氣和污染水體的危害識別和化學(xué)防護(hù)劑的篩選提供簡便方法;第二部分是化學(xué)防護(hù)劑迷迭香的篩選研究,再通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)和建立的TPM誘導(dǎo)DNA損傷的高通量篩查方法對迷迭香多種成分進(jìn)行防護(hù)功效驗(yàn)證,篩選到細(xì)胞毒性低、防護(hù)效果強(qiáng)的成分迷迭香酸;第三部分是從轉(zhuǎn)錄組水平對迷迭香酸的化學(xué)防護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究,確定其關(guān)鍵信號通路并進(jìn)行驗(yàn)證,最終繪制迷迭香酸防護(hù)卷煙煙氣損傷的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究第一部分建立了DNA損傷標(biāo)記物γH2AX高通量檢測、染色體損傷標(biāo)記物微核試驗(yàn)自動化檢測、細(xì)菌回復(fù)突變檢測這三類DNA損傷高通量篩查方法。首先采用高內(nèi)涵細(xì)胞儀,通過雙染料Hoechst和標(biāo)記γH2AX抗體的FITC來識別細(xì)胞的背景和γH2AX的熒光,提高了檢測的準(zhǔn)確性,建立起高內(nèi)涵檢測DNA損傷標(biāo)記物γH2AX的方法。研究結(jié)果表明:隨著TPM暴露濃度的增加,γH2AX單個細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度呈上升趨勢,當(dāng)TPM暴露濃度為80?g/mL時,γH2AX單個細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度達(dá)到最高;當(dāng)暴露時間在12h,不同劑量TPM誘導(dǎo)的γH2AX單個細(xì)胞核平均熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。其次對細(xì)胞掃描分析技術(shù)與細(xì)胞微核的定量識別方法進(jìn)行研究,建立了流式細(xì)胞儀法、計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測法及高內(nèi)涵篩選法,并對14個品牌卷煙的卷煙TPM樣品進(jìn)行微核檢測,與人工顯微鏡檢法獲得的微核率具有良好相關(guān)性,這三個方法均可用于卷煙煙氣誘導(dǎo)體外細(xì)胞微核的高通量檢測。研究還對細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)微量波動法在TPM致突變檢測中的進(jìn)行了改良和優(yōu)化使其可以快速檢測TPM誘導(dǎo)的基因突變。最后將體外微核流式細(xì)胞儀法和Ames試驗(yàn)微量波動法應(yīng)用到污染水體危害識別中,成功識別出污染水體樣品的致突變性危害。天然化學(xué)防護(hù)劑需要具備無毒或低毒和靶點(diǎn)明確的特點(diǎn)。本研究第二部分采用永生化腫瘤細(xì)胞A549和HepG2、TP53突變型(p53-/-+S+Ras)及野生型(P53-/-+V+Ras)細(xì)胞及永生化正常細(xì)胞CHO和HPF,考察了迷迭香幾種成分和提取物包括鼠尾草酸(CA)、鼠尾草酚(CS)、熊果酸(UA)、迷迭香酸(RA)、迷迭香精油(RO)和迷迭香水溶性提取物(RE)的毒性作用,尋找對正常細(xì)胞無毒性作用的劑量范圍。結(jié)果表明:CA在CHO細(xì)胞中IC_(50)值最低,其次是HPF細(xì)胞,說明CA對正常細(xì)胞毒性相對要大;CS卻是在腫瘤細(xì)胞A549和HepG2中IC_(50)值最低,而RA、RO和RE對正常細(xì)胞(CHO和HPF)的毒性作用較低。進(jìn)一步采用Annexin V/PI雙染色法考察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明:CA、CS、UA、RA導(dǎo)致CHO細(xì)胞的壞死比率顯著高于凋亡比率,但RA導(dǎo)致細(xì)胞壞死的比率只有CA、CS和UA的一半,且對細(xì)胞凋亡的影響相對小。由此可得出結(jié)論:鼠尾草酸、鼠尾草酚、熊果酸對細(xì)胞毒性較大,迷迭香酸、迷迭香精油和迷迭香水溶性提取物的細(xì)胞毒性相對較小。本研究第二部分采用MTT細(xì)胞毒性方法、Ames試驗(yàn)微量波動法試驗(yàn)和細(xì)胞微核試驗(yàn)高內(nèi)涵法來驗(yàn)證和篩選迷迭香的防護(hù)功效和有效成分。防護(hù)作用的研究方法為先用迷迭香保護(hù)細(xì)胞24小時,再用TPM暴露細(xì)胞24小時。結(jié)果表明:在MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)中,CA、CS、UA在70μg/mL劑量范圍內(nèi),對TPM誘導(dǎo)的毒性作用明顯大于防護(hù)作用,而RA在90μg/mL劑量范圍內(nèi),對TPM誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有明顯的防護(hù)作用,RO和RE在150μg/mL劑量范圍內(nèi),仍有一定的防護(hù)作用,且在HPF細(xì)胞上的防護(hù)作用比CHO細(xì)胞更為明顯。在細(xì)菌回復(fù)突變微量波動法試驗(yàn)中,TPM誘導(dǎo)TA98回復(fù)菌落數(shù)為47孔/50孔,CA、CS和RA在最大劑量0.8mg/50孔時,可使TA98誘發(fā)的回復(fù)菌落降低到正常自發(fā)回變范圍,且有明顯的劑量依存關(guān)系,因而具有很強(qiáng)的抗突變作用,而UA、RO和RE的抗突變性表現(xiàn)相對弱一些。進(jìn)一步采用體外微核試驗(yàn)高內(nèi)涵法驗(yàn)證低毒且有效的成分RA對TPM誘導(dǎo)遺傳毒性的防護(hù)作用,結(jié)果表明:RA劑量為20-80μg/m L劑量范圍內(nèi),TPM對經(jīng)過RA預(yù)保護(hù)的HPF細(xì)胞,所誘導(dǎo)的微核數(shù)比起未經(jīng)保護(hù)的細(xì)胞顯著性降低,說明RA對TPM誘導(dǎo)的染色體損傷有顯著的防護(hù)作用。在第三部分里對已經(jīng)確定迷迭香酸化學(xué)防護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了探索,我們首先采用RNA-Seq分析手段,對六組樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序、GO分析和GSEA基因富集分析,這六組樣品分別為單純TPM暴露6h組(TS)、單純TPM暴露24h組(TL)、單純細(xì)胞對照組(CC),單純RA預(yù)處理組(RC)、RA預(yù)處理后加TPM暴露6h組(RTS)、RA預(yù)處理后加TPM暴露24h組(RTL)。結(jié)果表明:TPM6h短期暴露(TS)顯著激活的BP、CC和MF的功能基因條數(shù)大于TPM24h長期暴露(TL);RA保護(hù)TPM6小時所引起的生物學(xué)事件主要是與細(xì)胞早期應(yīng)激相關(guān),而RA保護(hù)TPM24小時所引起的生物學(xué)事件主要是與DNA修復(fù)、染色體相關(guān),并富集到了G2M檢查點(diǎn)、血管生成以及IL6-JAK-STAT3信號通路。GSEA分析結(jié)果顯示差異基因被富集到多個基因集中,根據(jù)這些基因集我們推測RA對TPM誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的防護(hù)作用可能通過如下幾個方面發(fā)揮作用:第1是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng),如過氧化物酶體、氧化應(yīng)激反應(yīng)、ROS通路;第2是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)代謝水平,如膽固醇同態(tài)、雌激素應(yīng)答、膽汁酸代謝、糖原、脂肪酸代謝;第3是調(diào)控細(xì)胞連接和運(yùn)動性,如細(xì)胞頂面連接;第4是調(diào)控細(xì)胞生長和凋亡,如P53通路,有絲分裂紡錘體、G2M檢查點(diǎn),DNA修復(fù)、KRAS信號通路和炎癥反應(yīng)。第5是調(diào)控細(xì)胞命運(yùn),如肌細(xì)胞生成和KRAS信號通、P53通路。結(jié)果顯示差異表達(dá)基因多次被富集到P53通路,而P53通路對DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成都有調(diào)控作用,故我們推測RA很可能通過調(diào)控P53通路來發(fā)揮作用。在接下來的研究中我們在細(xì)胞水平和蛋白水平驗(yàn)證了RA對TPM誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的防護(hù)作用。通過檢測ROS、線粒體膜電位、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和DNA損傷標(biāo)記物γH2AX,明確了TPM誘導(dǎo)的各種細(xì)胞損傷以及RA的防護(hù)作用。結(jié)果顯示:TPM能夠劑量依賴地引起細(xì)胞增殖抑制,能夠劑量依賴地引起細(xì)胞凋亡和壞死,能夠誘導(dǎo)線粒體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生、線粒體膜電位下降,引起細(xì)胞的氧化損傷,并能迅速誘導(dǎo)γH2AX聚集到細(xì)胞核,還促使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。而RA預(yù)處理則可以明顯降低TPM誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)生、DNA損傷以及細(xì)胞凋亡水平。我們的P53信號通路相關(guān)蛋白的Western Blot檢測結(jié)果顯示:TPM能夠激活P53信號通路、下調(diào)SIRTl,增加p21蛋白的表達(dá),使Bax、Bcl-2表達(dá)量增大;而RA預(yù)處理,可以抑制ROS的產(chǎn)生,SIRTl表達(dá)上調(diào),MDM2表達(dá)下降,影響P53蛋白的磷酸化和乙酰化�？傊�,從轉(zhuǎn)錄組結(jié)果和P53信號通路相關(guān)蛋白的Western Blot結(jié)果推測:迷迭香酸可能抑制ROS產(chǎn)生并激活SIRTl信號通路,通過p53蛋白的磷酸化和乙�；{(diào)控MDM2途徑以及SIRTl途徑,抑制下游的凋亡蛋白Bax和切割caspase表達(dá)來有效地抑制TPM誘導(dǎo)的氧化損傷;RA還能通過增加細(xì)胞周期阻滯p21蛋白表達(dá)來使細(xì)胞獲得足夠的自我修復(fù)的時間從而抵抗TPM的損傷。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X701
【圖文】：

檢測與圖像分析 HCS 的各種相關(guān)參數(shù)，并掃描獲取 Hoechst 通道及 FITC成后使用 HCS 上配置的分析軟件進(jìn)行分析，計算單個細(xì) 通道的單個細(xì)胞核平均熒光值。用 Hoechst 通道的單個照，比較γH2AX 單個細(xì)胞核平均熒光值的變化，用其評果與分析γH2AX 檢測的數(shù)據(jù)分析異構(gòu)酶抑制劑依托泊苷誘導(dǎo) CHO 細(xì)胞的γH2AXs 分析軟件對所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲取的部分圖如下a b

圖 2.2 體外微核分析試劑盒法檢測 CHO 細(xì)胞微核的原理圖.2.1.2 有核細(xì)胞微核的激光掃描全自動檢測方法原理下圖為美國 CompuCyte 公司 LSC 工作原理圖。

23圖 2.2 體外微核分析試劑盒法檢測 CHO 細(xì)胞微核的原理圖2.2.1.2 有核細(xì)胞微核的激光掃描全自動檢測方法原理下圖為美國 CompuCyte 公司 LSC 工作原理圖。圖 2.3 LSC（CompuCyte 公司）工作原理圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2754175