【摘要】：隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物已成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來(lái)源,對(duì)其合理處置是當(dāng)前亟待解決的問題。厭氧發(fā)酵是處理養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物的重要方式,可通過多種功能微生物協(xié)同作用產(chǎn)生清潔能源,發(fā)酵過程產(chǎn)生的沼液和沼渣還可作為有機(jī)肥施入農(nóng)田實(shí)現(xiàn)畜禽糞便的資源化利用。氮素是農(nóng)作物所必需的重要營(yíng)養(yǎng)元素,養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物厭氧發(fā)酵過程中反硝化微生物可將氮轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w,影響發(fā)酵過程,降低沼液和沼渣的肥效。因此,明確厭氧發(fā)酵反硝化過程中氮素轉(zhuǎn)化機(jī)理及其影響因素,對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物厭氧資源化利用具有重要意義。由于抗生素和重金屬具有防治畜禽疾病和促生長(zhǎng)的作用,被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中,導(dǎo)致其在畜禽糞便中大量殘留,對(duì)厭氧發(fā)酵中反硝化過程有一定影響。本文研究了發(fā)酵參數(shù)(溫度和固體含量)、殘留污染物(重金屬和抗生素)和添加劑(沸石)對(duì)厭氧發(fā)酵過程中反硝化功能基因豐度、微生物群落及功能代謝的影響,分析了厭氧發(fā)酵過程中氮素轉(zhuǎn)化、反硝化功能基因和微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系及其影響因素,揭示了不同因素對(duì)厭氧發(fā)酵中反硝化過程影響機(jī)理,以期減少厭氧發(fā)酵過程氮素?fù)p失。取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:(1)中溫厭氧發(fā)酵(35℃)過程中編碼氧化亞氮還原酶nosZ基因的豐度較高,且發(fā)酵過程中N_2和N_2O累積排放量低于高溫厭氧發(fā)酵(55℃)。Pseudomonas、Enterococcus、Petrimonas和Bacillus是發(fā)酵過程中主要的反硝化微生物,其中Petrimonas在中溫發(fā)酵中豐度較高,而Bacillus在高溫發(fā)酵中豐度較高。冗余分析表明,pH、溫度和NH_4~+-N是反硝化微生物變化的主要驅(qū)動(dòng)因子。溫度改變了微生物群落共現(xiàn)性和發(fā)酵過程中關(guān)鍵微生物,高溫發(fā)酵增加了微生物之間負(fù)相互作用。相較而言,中溫發(fā)酵中微生物Network結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,發(fā)酵體系更穩(wěn)定且氮素?fù)p失較少。(2)不同固體含量改變了厭氧發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和共現(xiàn)性模式,影響了關(guān)鍵微生物類群,濕式發(fā)酵(總固體含量=8%)中關(guān)鍵類群為Alistipes、Christensenellaceae、Petrimonas、Flavobacterium和Syntrophomonadaceae,而干式發(fā)酵(總固體含量=20%)中關(guān)鍵類群為L(zhǎng)utispora、Methanobacterium、Anaerocella、Caproicipro和Bacteroides。Methanobacteriaceae、Methanosarcinaceae和Methanocorpusculaceae、Methanomicrobiaceae分別是濕式發(fā)酵和干式發(fā)酵中主要產(chǎn)甲烷古菌,濕式發(fā)酵后期促進(jìn)了乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑。冗余分析表明,VFAs和pH是影響微生物變化的主要因子。PICRUSt功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明,不同固體含量厭氧發(fā)酵中微生物群落功能代謝不同,干式發(fā)酵中反硝化和氨化過程相關(guān)酶基因豐度低于濕式發(fā)酵。(3)銅增加了厭氧發(fā)酵過程中N_2O/(N_2O+N_2)比率,對(duì)N_2O還原為N_2的過程有一定抑制作用,進(jìn)而導(dǎo)致N_2O積累。銅改變了厭氧發(fā)酵過程中微生物群落組成,降低了厭氧發(fā)酵初期微生物群落Chao1、Shannon和Simpson多樣性指數(shù),這種作用隨著銅濃度的增加而增加。發(fā)酵過程中,nirS和nirK基因?qū)Σ煌瑵舛茹~的壓力表現(xiàn)出不同的響應(yīng),高濃度銅對(duì)編碼氧化亞氮還原酶nosZ基因抑制作用更明顯。冗余分析可知,微生物群落變化對(duì)功能基因差異解釋率最高,pH、SCOD、Bio-Cu和NO_3~--N為微生物群落變化的主要驅(qū)動(dòng)因子。說明銅影響了微生物群落,從而間接改變了參與反硝化過程的功能基因豐度。(4)10 mg/kg泰樂菌素增加了N_2O排放量,同時(shí)減少了N_2的排放,說明低濃度的泰樂菌素對(duì)N_2O消耗過程的抑制作用強(qiáng)于N_2O產(chǎn)生的過程,而100 mg/kg泰樂菌素增加了N_2O和N_2的排放。Enterococcus和Pseudomonas為發(fā)酵后期10 mg/kg泰樂菌素處理中主要的反硝化菌屬,Halomonas在100 mg/kg泰樂菌素處理中豐度顯著增加,說明厭氧發(fā)酵中反硝化微生物對(duì)不同濃度泰樂菌素的響應(yīng)不同。反硝化功能基因、抗生素抗性基因、整合子基因和微生物群落的共現(xiàn)性表明,反硝化功能基因與抗生素抗性基因可能位于同一潛在宿主菌中,并通過整合子基因進(jìn)行傳播,IntI1在基因水平轉(zhuǎn)移中起重要作用。(5)在一定范圍內(nèi),高濃度沸石(5%)能夠有效削減發(fā)酵產(chǎn)物中抗生素抗性基因,降低重金屬生物有效性。16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明,沸石增加了微生物群落Chao1、Shannon和Simpson多樣性指數(shù),改變了微生物群落結(jié)構(gòu),增加了發(fā)酵產(chǎn)物中Spirochaetes和Fibrobacteres豐度。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,5%沸石添加量顯著增加了厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中nosZ基因豐度,會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)物后續(xù)資源化利用過程中N_2O排放潛力。冗余分析表明,VFAs、pH、NO_3~--N和Bio-Cu是引起反硝化功能基因差異的主要環(huán)境因子。綜上所述,溫度和固體含量改變了發(fā)酵過程中微生物群落共現(xiàn)性模式和關(guān)鍵微生物類群,中溫發(fā)酵氮素?fù)p失較少,干式發(fā)酵中反硝化和氨化過程代謝活性低。銅改變了微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響反硝化基因,抑制了N_2O還原過程。泰樂菌素增加了反硝化基因與抗生素抗性基因在物種間的水平轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致了厭氧發(fā)酵過程中較高的氮素?fù)p失。添加5%沸石能有效減輕抗生素和重金屬危害,減少發(fā)酵產(chǎn)物中N_2O排放潛力。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S216.4;X713
【圖文】：

圖 1-1 氮素循環(huán)過程Figure 1-1 Microbiology of nitrogen cycle硝化過程包括氨氧化和 NO2-氧化兩個(gè)相互獨(dú)立的過程。有氧條件下，好氧氨氨氧化酶催化完成（Prosser and Nicol 2008）。Maeda et al.（2010）利用 DG好氧堆肥過程中微生物群落，結(jié)合測(cè)序比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Nitrosomonas 是堆肥束過程中的優(yōu)勢(shì)硝化菌。厭氧條件下，則是通過聯(lián)胺氧化還原酶（hzo 基因編進(jìn)行，該反應(yīng)將 NH4+ N 和 NO2- N 作為底物，生成 N2和 H2O，這個(gè)過程氨氧化過程。目前厭氧氨氧化方面的研究，主要是在海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)及系統(tǒng)（Huet al.2011；Schmidetal.2007），已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化微生物均隸屬門（Zhu et al. 2010）。固氮過程是指固氮微生物將環(huán)境中的氮?dú)猓∟2）轉(zhuǎn)化為氨（NH3/NH4+）的過ifH 基因編碼固氮酶催化完成（DosSantosandDean2011）。普遍認(rèn)為固氮功能于原核生物，存在于100多個(gè)細(xì)菌和古菌屬，大部分屬于變形菌門（Proteobact細(xì)菌門（Cyanobacterial）。有學(xué)者研究了輪作對(duì)灘涂土壤固氮群落結(jié)構(gòu)的影響

圖 1-2 傳統(tǒng)和現(xiàn)代反硝化電子理論差異（Pan et al. 2013a）Figure 1-2 Electron competition in the microorganism of denitrification硝化作用酶系及相關(guān)功能基因還原酶，催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的過程。包括由 narG 基因編原酶（NAR）和由 napA 基因編碼周質(zhì)硝酸鹽還原酶（NAP），而 N亞基，分別由 napA 基因（為催化亞基）、napB 基因（含有細(xì)胞色素t 2002）。位于膜內(nèi) NAR 對(duì)氧分子敏感，較高的 O2濃度對(duì)它有顯著細(xì)胞周質(zhì)的硝酸鹽還原酶 NAP 的表達(dá)對(duì)氧分子不敏感。過程中的關(guān)鍵步驟是亞硝酸鹽還原為一氧化氮，亞硝酸鹽還原酶（的限速酶，易受 NO3-誘導(dǎo)和 O2抑制，由 nirS 編碼的 Cyt cd1 型 nirK 編碼的 Cu 型亞硝酸鹽還原酶催化的（Fan et al. 2015）。亞硝被用作自然界反硝化的分子標(biāo)記，揭示多種生態(tài)位中種群結(jié)構(gòu)的多l(xiāng).（2000）利用 nirS 及 nirK 基因表征反硝化功能微生物的多樣性，代分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展和及其在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用，為利用特相似生理功能的微生物群落提供了新的模式和途徑。有學(xué)者研究了

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