【摘要】：石油烴厭氧降解產(chǎn)甲烷過程的研究對于深入認(rèn)識油藏環(huán)境石油烴厭氧降解、油污染環(huán)境微生物修復(fù)以及殘余油氣化技術(shù)具有重要的理論意義和實(shí)用價值。目前,對于厭氧烴降解產(chǎn)甲烷過程的研究大多都基于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)研究,對于長期培養(yǎng)的厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的組成及其變化的研究卻很有限。本文利用不同來源樣品(油藏產(chǎn)出液和含油活性污泥)成功地構(gòu)建了兩個厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系,通過分子生物學(xué)和化學(xué)分析方法,研究了這兩個菌系的菌群組成、功能基因以及代謝產(chǎn)物的特征,探討了菌系中的菌群動態(tài)變化和可能存在的代謝機(jī)制。 提出了一種由羧酸合成特定位置氘代烷烴的“兩步法”,壬酸發(fā)生a位置氘代和Kolbe電解反應(yīng),在優(yōu)化的反應(yīng)條件下制備8,8,9,9-d4-十六烷,用作厭氧烴降解培養(yǎng)的底物進(jìn)行代謝途徑的研究。該方法也可以用于合成其它相鄰兩個碳原子氘代的烷烴。 以油藏產(chǎn)出液為基礎(chǔ),構(gòu)建了高溫厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系。加入混合烷烴(C15-C20)在55℃富集培養(yǎng)749天的樣品中檢測到141μmol甲烷,約占理論產(chǎn)甲烷量的17.1%。GC-MS檢測到多種可能的下游代謝產(chǎn)物(包括直鏈脂肪酸、揮發(fā)性脂肪酸和延胡索酸)存在,同時說明從烷烴到甲烷的轉(zhuǎn)化并不完全。16S rRNA基因克隆文庫分析表明,該厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的菌群結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過程中發(fā)生了變化。長期加烴富集培養(yǎng)體系中細(xì)菌是以Firmicutes的Gelria和Moorella為主,古菌的主要類型為Crenarchaeotes以及氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。另外,富集培養(yǎng)樣品中都檢測到了類似于編碼烷基琥珀酸合成酶α-亞基的功能基因(assA),特別在培養(yǎng)749天的樣品中檢測到一種不同類型的assA基因,說明富集培養(yǎng)中存在著有烴降解功能的微生物。在該加烴富集培養(yǎng)中可能存在的厭氧烴降解產(chǎn)甲烷代謝途徑為：在Firmicutes和Crenarchaeotes類型厭氧菌的作用下,烷烴可能通過延胡索酸加成的方式進(jìn)行初始活化,再被連續(xù)降解為脂肪酸之后,轉(zhuǎn)化為甲酸、乙酸、氫氣和二氧化碳,并由乙酸營養(yǎng)型和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)生甲烷,產(chǎn)甲烷過程以二氧化碳還原途徑為主。 含油活性污泥菌系中,加入混合烷烴(C15-C20)在37℃富集培養(yǎng)后,檢測到314μmol甲烷產(chǎn)生,有37.3%的烷烴被消耗。分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)過程中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,最終細(xì)菌的主要類型為Clostridia、Actinobacteria、Synergistaceae和Chloroflexi,古菌是以乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為主。將富集培養(yǎng)406天的不加烴對照分別加入十六烷、全氘代十六烷和8,8,9,9-d4-十六烷進(jìn)行轉(zhuǎn)接,經(jīng)過660天的培養(yǎng),均檢測到甲烷的產(chǎn)生和烷烴的消耗。特別是在加入8,8,9,9-d4-十六烷的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中,甲烷的產(chǎn)量為107μmol,約占理論產(chǎn)甲烷量的83.6%,這也進(jìn)一步證明該菌系具有厭氧烴降解產(chǎn)甲烷的活性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,所有轉(zhuǎn)接培養(yǎng)樣品中都檢測到assA類基因,菌群結(jié)構(gòu)也都經(jīng)歷了一些變化,最終細(xì)菌的主要類型為Chloroflexi、Synergistaceae、Actinobacteria和Deltaproteobacteria,古菌以乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為主,但在產(chǎn)甲烷活性較高的加入8,8,9,9-d4-十六烷的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)則是以氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為主。在該轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中,烷烴可能通過延胡索酸加成的方式進(jìn)行初始活化,并由大量共生發(fā)酵菌將烷烴連續(xù)厭氧轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)(如乙酸),再由乙酸營養(yǎng)型和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)生甲烷,并以二氧化碳還原產(chǎn)甲烷的途徑為主。 通過對上述兩個不同來源的厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的分析發(fā)現(xiàn),它們的菌群組成等方面存在明顯差異,含油活性污泥中富含有機(jī)質(zhì),使得菌群結(jié)構(gòu)更為多樣。這也說明不同的樣品來源、底物以及培養(yǎng)條件會對厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌系的菌群組成產(chǎn)生影響,可能也會影響整個菌系實(shí)際厭氧烴降解產(chǎn)甲烷的能力。本文的研究結(jié)果豐富了厭氧烴降解產(chǎn)甲烷微生物的多樣性,增加了對于厭氧烴降解產(chǎn)甲烷菌群結(jié)構(gòu)變化的了解,也拓展了對于功能基因等方面的認(rèn)識,對厭氧烴降解產(chǎn)甲烷機(jī)制的研究、功能微生物的篩選和評價以及厭氧烴降解產(chǎn)甲烷活動的監(jiān)測具有重要價值。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：X703

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本文編號：2710922