【摘要】：土壤是重金屬的一個重要蓄積庫,其所含重金屬的毒性不僅與其總量有關(guān),更大程度上由其形態(tài)分布所決定,其中重金屬的生物可利用性含量部分可以通過食物鏈被植物、動物數(shù)十倍地富集,從而對人體健康造成危害。土壤中的微生物是土壤有機(jī)組分和生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分,在促進(jìn)土壤質(zhì)量和植物健康方面發(fā)揮著重要的作用,被認(rèn)為是最敏感的土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)。重金屬對土壤中微生物的生態(tài)效應(yīng)一方面表現(xiàn)在生物量、代謝活性、種類數(shù)量和多樣性降低；一方面又因為重金屬的選擇和生物的適應(yīng)性反應(yīng),使得污染環(huán)境中生長有大量耐受重金屬污染的類群�？梢哉f,微生物群落組成和多樣性動態(tài)變化,能反映土壤中生物類群的多變性和土壤質(zhì)量在微生物數(shù)量和功能上的差異性。為了更好地了解土壤健康狀況,了解重金屬污染對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,非常有必要深入對污染土壤的微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)組成以及與重金屬相互作用關(guān)系等進(jìn)行研究。本文以德興銅礦4#尾砂庫為研究對象,采集尾砂樣品以及周圍農(nóng)田和菜地土壤樣品共16件進(jìn)行相關(guān)分析研究。 (1)對樣品中重金屬以及其他元素總量進(jìn)行測定,采用Tessier順序提取方法對重金屬Cu, Cd和Zn進(jìn)行形態(tài)分析,然后分別根據(jù)總量采用國標(biāo)方法(GB15618-1995)以及根據(jù)重金屬生物可利用性含量采用風(fēng)險評價編碼(Risk Assessment Code, RAC)兩種方法評價土壤重金屬污染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)樣品受到不同程度的Cu、Cd、Zn、Ni、Pb、和Cr的污染,說明該尾礦庫重金屬污染對周邊農(nóng)業(yè)土壤有影響。形態(tài)分析結(jié)果表明,Cu主要以有機(jī)結(jié)合態(tài)和殘渣態(tài)存在；Cd主要以離子交換態(tài)存在；Zn在大部分樣品中主要以殘渣態(tài)存在。采用兩種方法對樣品中重金屬Cu、Cd和Zn環(huán)境風(fēng)險進(jìn)行評價,結(jié)果表明除了重金屬Cd評價的結(jié)果比較一致外,對于重金屬Cu和Zn,大部分樣品中兩種評價結(jié)果存在明顯差異。從研究結(jié)果來看,該地區(qū)重金屬Cd污染已經(jīng)達(dá)到了污染非常嚴(yán)重的程度,需要人們給予更多的關(guān)注。同時,從結(jié)果來看我們認(rèn)為一個適當(dāng)?shù)�、充分的、合理的環(huán)境風(fēng)險評價標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該同時包含重金屬總量和生物可利用性含量兩部分標(biāo)準(zhǔn)。本文對德興銅礦4#尾礦庫及周邊農(nóng)業(yè)土壤樣品進(jìn)行重金屬形態(tài)分析,并結(jié)合風(fēng)險評價編碼(RAC)方法首次根據(jù)重金屬可利用性含量對該地區(qū)長期受重金屬土壤樣品進(jìn)行重金屬污染風(fēng)險評價,具有重要參考價值。 (2)樣品中微生物分子生態(tài)多樣性變化情況研究。首先對16個樣品中可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行平板計數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在尾砂樣品T4和T7中可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量最少,約0.5×107cfu/g土壤干重；在菜地土壤樣品中為1.40-2.75×107cfu/g土壤干重,在農(nóng)田土壤樣品中為0.60-3.60×107cfu/g土壤干重。 對不同土壤樣品16S rDNA V3區(qū)片斷擴(kuò)增產(chǎn)物采用變性梯度凝聚電泳(DGGE)進(jìn)行分離,獲得DNA指紋圖譜,采用Quantity One軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析等,發(fā)現(xiàn)尾砂樣品T4和T7相似性比較高,達(dá)56.4%；菜地土壤樣品中V11、V13、V15、V18和V20基本聚類在一起,而V8與其它樣品都分離開來,說明該樣品中微生物多樣性與其他樣品相比差異比較大；農(nóng)田土壤樣品中G10、G12、G14和G16聚類在一起,而樣品G17、G19和G21聚類在一起。 對樣品進(jìn)行多樣性指數(shù)(Shannon-Weaver index H)計算,結(jié)果發(fā)現(xiàn)多樣性最大出現(xiàn)在距離尾礦中等距離的樣品中如菜地土壤樣品V13、V15,農(nóng)田土壤樣品G12和G14等,在這些樣品中重金屬銅和鋅的含量不高,均不超過國家土壤質(zhì)量Ⅱ級標(biāo)準(zhǔn),但也不是最低；在重金屬銅和鋅含量都是最高的菜地土壤樣品V8、農(nóng)田土壤樣品G10中,以及在重金屬銅和鋅含量幾乎都是最低,遠(yuǎn)離尾礦10 km之外的菜地土壤樣品V20和農(nóng)田土壤樣品G19中,微生物的多樣性指數(shù)相近,且均低于最大值。說明重金屬濃度對微生物多樣性的影響可能并不是簡單的線性關(guān)系,在一定的濃度范圍內(nèi)有可能促進(jìn)微生物多樣性的發(fā)展。 (3)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成研究。主要是采用以PCR為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)方法,結(jié)合分子克隆構(gòu)建基因文庫,16S rDNA測序等,對樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析。共獲得236OTUs (Operational Taxonomic Units),測序后各個樣品中菌種數(shù)分別為T4(9種),V8(56種),V20(40種),G10(56種)和G19(46種)。 根據(jù)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),在五個樣品中優(yōu)勢菌種主要有：uncultured Pseudoxanthomonas sp. clone GI5-005-C10, Burkholderia sp.383, uncultured Acinetobacter sp. clone TCCC 11180等十多種。進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,發(fā)現(xiàn)在五個樣品中共207種細(xì)菌被劃分為15大類,即Acidobacteria綱,Actinobacteria綱,Bacteroidetes綱等細(xì)菌。在尾砂T4樣品中86%的細(xì)菌克隆子數(shù)歸屬于Y-proteobacteria類群,是該樣品中絕對優(yōu)勢菌群；在菜地土壤樣品V8中,菌群分布為：γ-proteobacteria,α-proteobacteria,δ-proteobacteria, Planctomycetes, Acidobacteria和Bacteroidetes,分別占細(xì)菌總克隆子數(shù)的14.5%,12%,8%,14.5%,10%和9.7%,為優(yōu)勢菌群；在菜地土壤樣品V20中,優(yōu)勢菌群依次為：γ-proteobacteria占25%,β-proteobacteria占16%,Cyanobacteria占12%,a-proteobacteria和Acidobacteria各占10%;在G10樣品中,占最優(yōu)勢主導(dǎo)地位的類群是β-proteobacteria,包含22.5%的克隆子數(shù),緊隨其后的優(yōu)勢類群分別是γ-proteobacteria,α-proteobacteria, Chloroflexi和Firmicutes,各占百分比10%；在樣品G19中,優(yōu)勢菌群依次是Acidobacteria,β-proteobacteria,α-proteobacteria, Chloroflexi和Planctomycetes,分別占G19樣品中155個有效克隆子百分比為22%,17%,14%,13%和11%�？偟膩砜�,在五個樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異是比較明顯的。T4尾砂樣品中細(xì)菌多樣性最少,群落結(jié)構(gòu)比較簡單,優(yōu)勢菌群單一,優(yōu)勢明顯；在菜地和農(nóng)田樣品中,細(xì)菌多樣性明顯增加,群落數(shù)增多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,優(yōu)勢菌群多元化,優(yōu)勢不明顯。與Janssen等人提出的典型健康土壤樣品中微生物多樣性及平均群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)本研究中的土壤樣品在長期的重金屬污染壓力條件之下,其中微生物群落結(jié)構(gòu)組成與健康土壤相比已經(jīng)發(fā)生了明顯改變,微生物的功能也可能發(fā)生了改變,使得這些土壤可能處于不健康狀態(tài)。 另外,采用PCA方法對重金屬Cu, Cd和Zn及各形態(tài)與微生物群落之間的相互關(guān)系在所研究樣品中首次進(jìn)行了分析討論。發(fā)現(xiàn)不同重金屬,不同重金屬形態(tài)對微生物群落分布都有不同影響。著重考慮重金屬生物可利用性含量(即離子交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)重金屬含量)與微生物群落之間的相互關(guān)系,發(fā)現(xiàn)離子交換態(tài)重金屬銅和鋅與細(xì)菌類群Act (Actinobacteria)、Bet (β-proteobacteria)、Chl (Chlorobi)、Chlo (Chloroflexi)、Fir(Firmicutes)之間相關(guān)性較大；碳酸鹽結(jié)合態(tài)銅和鋅與細(xì)菌類群Bac (Bacteroidetes)和Ver (Verrucomicrobia)緊密相關(guān)；離子交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)重金屬鎘與細(xì)菌類群Gam (γ-proteobacteria)相關(guān)性尤為顯著。我們認(rèn)為或可根據(jù)微生物群落與重金屬生物可利用性含量之間的相關(guān)性,用微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來指示重金屬生物可利用性含量的變化,比如用Gam (γ-proteobacteria)類群數(shù)量變化來指示重金屬鎘的生物可利用性含量變化等。 (4)重金屬高抗性菌株分離鑒定及基本性質(zhì)研究。采用平板分離的辦法,經(jīng)重金屬梯度濃度誘導(dǎo)培養(yǎng),從尾礦樣品中分離篩選到三株重金屬高抗性菌株：菌株DX-T3-01在鎘濃度10 mM/L的固體平板和18 mM/L液體培養(yǎng)基中生長良好,在鎘濃度16 mM/L的固體平板上能生長；DX-T3-02在銅濃度3 mM/L的固體平板和6 mM/L液體培養(yǎng)基中生長良好,在銅濃度5 mM/L的固體平板上能生長；菌株DX-T3-03在鋅濃度為35 mM/L固體平板和30 mM/L液體培養(yǎng)基中生長良好,在鋅濃度50 mM/L的固體平板上能生長。 三株菌進(jìn)行生理生化特性研究以及16S rDNA的同源性分析比對,發(fā)現(xiàn)菌株DX-T3-01與Ralstonia pickettii的菌株(GenBank登錄號為CP001069)同源性為99%,菌株DX-T3-02與Methylobacterium sp的菌株(GenBank登錄號為AM910531)同源性為99%,菌株DX-T3-03與Sphingomonas sp.的菌株(GenBank登錄號為AF131295)同源性為99%。分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)其基因進(jìn)化距離與同屬菌種很近,與不同屬的菌種相距較遠(yuǎn),將三株菌分別命名為：Ralstonia pickettii strain DX-T3-01, Methylobacterium sp. strain DX-T3-02和Sphingomonas sp. strainDX-T3-03。本文分離到的這三株菌與已報道的同種屬其他菌株相比,在重金屬抗性方面具有非常顯著優(yōu)勢�？赏蔀榇_發(fā)的重金屬生物修復(fù)優(yōu)良菌劑。 初步應(yīng)用DGGE方法來檢測特殊菌種在環(huán)境樣品中的分布情況,發(fā)現(xiàn)三株菌在不同樣品中的分布和豐度存在較大差異。基本上Ralstonia pickettii strainDX-T3-01在尾砂樣品和距離尾礦庫距離較近的幾個樣品中廣泛存在,且數(shù)量較多,可能為各樣品中優(yōu)勢菌種之一。Methylobacterium sp. strain DX-T3-02只在尾砂樣品T4和菜地土壤樣品V8中存在且特征條帶亮度較大,在其他樣品中極微弱存在或不存在,說明該菌種的分布受樣品性質(zhì)影響較大,特異性比較明顯。而Sphingomonas sp. strain DX-T3-03在尾砂樣、各菜地土壤樣品和農(nóng)田土壤樣品中都有特征條帶存在,亮度不大,說明該菌種分布廣泛,特異性不明顯,菌數(shù)量少,在各樣品中一般為非優(yōu)勢菌株。該方法有可能利用來進(jìn)行重金屬污染監(jiān)測,尋找重金屬污染微生物標(biāo)記物,開發(fā)重金屬污染快速檢測技術(shù)等。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：X53

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本文編號：2708615