【摘要】：環(huán)境污染問(wèn)題變的日益突出,尤其是重金屬和抗生素這兩大環(huán)境污染物無(wú)處不在,汞是毒性最大的金屬污染物之一,在環(huán)境中最常見(jiàn)的有兩種形式,即無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞,其中無(wú)機(jī)汞所占的比例較大;但是,有機(jī)汞是汞最毒的一種存在形式,具有神經(jīng)毒性,對(duì)人類造成不可逆轉(zhuǎn)的危害;甲基汞是最常見(jiàn)的有機(jī)汞,人類攝入的甲基汞主要來(lái)自于魚(yú)類的消費(fèi),魚(yú)體內(nèi)94%以上的汞是以甲基汞的形式存在,而且人體攝入的甲基汞會(huì)長(zhǎng)期積累在體內(nèi)。此外,抗生素是一種新型的環(huán)境污染物,我國(guó)是一個(gè)抗生素生產(chǎn)和使用量最大的國(guó)家,其中大部分的抗生素應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)。人和動(dòng)物服用的抗生素大部分(50%~90%)不能被完全吸收和代謝,導(dǎo)致大量的抗生素以原始形式隨排泄物排放到環(huán)境中,對(duì)人類的健康造成巨大的威脅。而且牲畜糞便中殘留的抗生素會(huì)抑制厭氧發(fā)酵過(guò)程中的甲烷生產(chǎn)。本文利用細(xì)胞表面展示技術(shù)對(duì)汞和抗生素的污染進(jìn)行微生物修復(fù),并將微生物的修復(fù)技術(shù)初步應(yīng)用于這些污染物的治理。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.浮游植物中所含的汞大多數(shù)為無(wú)機(jī)汞,進(jìn)入食物鏈以后會(huì)不斷的富集放大。文中將無(wú)機(jī)汞結(jié)合多肽通過(guò)冰晶核蛋白的錨定作用展示在大腸桿菌細(xì)胞表面獲得工程菌株,發(fā)現(xiàn)工程菌株在不同金屬離子溶液中可以選擇性的吸附無(wú)機(jī)汞,對(duì)無(wú)機(jī)汞的最大吸附能力可達(dá)394.9μmol/g細(xì)菌干重。與對(duì)照細(xì)胞相比,無(wú)機(jī)汞的吸附能力提高了4倍,能去除約95%的無(wú)機(jī)汞。以可食用的鯽魚(yú)作為研究模型,工程菌株投喂給鯽魚(yú)并在鯽魚(yú)腸道內(nèi)定植,發(fā)現(xiàn)定植在魚(yú)腸道內(nèi)的工程菌株可以減少魚(yú)體內(nèi)無(wú)機(jī)汞含量的51.1%,同時(shí)促進(jìn)了無(wú)機(jī)汞在糞便中的排除。工程菌株有效的保護(hù)鯽魚(yú)不受環(huán)境中無(wú)機(jī)汞的污染,通過(guò)吸附作用緩解無(wú)機(jī)汞在魚(yú)體內(nèi)的毒性,而且工程菌株緩解了魚(yú)腸道微生物在汞暴露條件下的變化,對(duì)魚(yú)腸道微生物起到保護(hù)作用,這一新的技術(shù)有望控制無(wú)機(jī)汞對(duì)魚(yú)類的污染。2.無(wú)機(jī)汞很容易被某些微生物轉(zhuǎn)化為甲基汞,而且甲基汞進(jìn)入食物鏈以后會(huì)不斷的積累。本文從健康鯽魚(yú)糞便中分離到一株大腸桿菌W-1,并將一個(gè)含有七個(gè)氨基酸的甲基汞結(jié)合多肽展示在大腸桿菌W-1細(xì)胞表面,此工程菌株對(duì)甲基汞具有很高的親和力和結(jié)合能力,在12μM甲基汞溶液中的吸附效率達(dá)96%以上,吸附效率是野生型大腸桿菌的4倍,而且不受其他金屬離子的干擾,溫度對(duì)工程菌株的吸附作用影響不大。而且通過(guò)透射電鏡確認(rèn)甲基汞吸附在工程菌株的細(xì)胞膜上。本實(shí)驗(yàn)以鯽魚(yú)作為動(dòng)物模型,將工程菌株喂給鯽魚(yú),發(fā)現(xiàn)食用了工程菌株的魚(yú)體內(nèi)甲基汞含量比沒(méi)有食用工程菌的魚(yú)降低了36.3%,而魚(yú)糞便中的甲基汞增加了36.7%。工程菌株吸附了甲基汞阻止其被魚(yú)體內(nèi)吸收,吸附了甲基汞的菌株最終隨糞便排出,通過(guò)這種方法可以減少甲基汞在魚(yú)體內(nèi)的富集。3.大量的抗生素應(yīng)用于養(yǎng)殖行業(yè)導(dǎo)致牲畜糞便中含有高濃度的抗生素殘留,這些殘留的抗生素會(huì)抑制后續(xù)的厭氧發(fā)酵。在該研究中,利用細(xì)胞表面展示技術(shù)將β-內(nèi)酰胺酶展示在大腸桿菌的細(xì)胞表面獲得全細(xì)胞生物催化劑的工程菌株,這個(gè)工程菌株具有較高的酶活(4.93 U/mg細(xì)菌干重),能高效降解β-內(nèi)酰胺類抗生素,與游離的β-內(nèi)酰胺酶相比,全細(xì)胞催化劑具有更高的穩(wěn)定性。在室溫條件下存放60天后的酶活性為最初酶活的82.7%,但是游離的β-內(nèi)酰胺酶的酶活性降為18.0%。100 mg/L的青霉素、頭孢唑林和阿莫西林分別在一小時(shí)內(nèi)可以完全降解。用全細(xì)胞催化劑前處理含有β-內(nèi)酰胺類抗生素的豬糞提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷(93.2%),他可以通過(guò)降解抗生素避免發(fā)酵體系中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,從而有利于產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)。這種新型的策略不僅消除了糞便中殘留的抗生素,而且還提高了甲烷產(chǎn)量,因此實(shí)現(xiàn)了可再生能源的最大化利用。4.紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素之一,廣泛應(yīng)用于藥療和畜禽等行業(yè),紅霉素是環(huán)境中檢出率較高的抗生素之一。利用細(xì)胞表面展示技術(shù)將紅霉素酯酶展示在大腸桿菌的細(xì)胞表面獲得全細(xì)胞生物催化劑的工程菌株,該工程菌株的紅霉素酯酶酶活力為1.0 U/mg細(xì)菌干重,酶活反應(yīng)的最佳溫度為30℃,最佳pH為7。全細(xì)胞生物催化劑能在24 h內(nèi)完全降解50 mg/L的紅霉素,酶的穩(wěn)定性很高,室溫下存放40天后依然能保持初始酶活的86%。此工程菌株可以回收利用,重復(fù)使用7次后的酶活性達(dá)最初活力的80%。為了減少環(huán)境中的紅霉素殘留,該全細(xì)胞生物催化劑用于含紅霉素的生活廢水處理,降解效率達(dá)100%。
【圖文】：

學(xué)博士學(xué)位論文 利用細(xì)胞表面展示技術(shù)去除典型環(huán)境污染物的研究機(jī)汞殘留的報(bào)道甚少。由于汞具有快速富集和緩慢排除的特點(diǎn)，，本章個(gè)能夠結(jié)合無(wú)機(jī)汞的多肽展示在細(xì)胞表面上獲得全細(xì)胞吸附劑，讓這附劑定植在魚(yú)腸道內(nèi)以期減少魚(yú)體內(nèi)的無(wú)機(jī)汞含量。因此，本章節(jié)將結(jié)合多肽通過(guò)基因工程的手段展示在大腸桿菌的細(xì)胞表面以期吸附以鯽魚(yú)（Carassius auratus）為動(dòng)物模型，測(cè)試工程菌株是否可以減汞含量（如下圖 2-1 所示）。

注：標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食+ E. coli GC：在每克標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食中含有 2 ×108CFU E. coli GC；標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食+ E. coli PC：在每克標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食中含有 2 ×108CFU E. coli PC；標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食+ Hg2+：在標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食中含有 Hg2+0.1 mg/kg。魚(yú)的實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，如下圖 2-2 所示，第一階段：最開(kāi)始的 10 天用含有工程菌株的魚(yú)食飼養(yǎng)，這樣可以使工程菌株定植在魚(yú)的腸道內(nèi)。第二階段：10天之后改變魚(yú)飼養(yǎng)的食物，換為含有 Hg2+的食物，持續(xù)飼養(yǎng) 30 天，整個(gè)魚(yú)實(shí)驗(yàn)周期為 40 天，每天投喂魚(yú)食兩次，所給的食物在 5 min 中內(nèi)食用完，未食用的殘留食物立即撈出來(lái)以免影響水質(zhì)，每天換 1/4 的水。魚(yú)糞的收集，喂食 2 h 后收集糞便，從魚(yú)缸底部吸出魚(yú)的糞便，通過(guò)離心（6000 rpm, 10 min）去除多余的水份。由于每次收集的糞便量較少，所以，同一組魚(yú)收集 5 次的糞便混合在一起測(cè)定總汞含量，取適量魚(yú)糞便加入 68%的濃硝酸過(guò)夜處理，再加 2 mL 30%過(guò)氧化氫，在消解爐里進(jìn)行消解，定容，過(guò)濾后利用 AFS 測(cè)定總 Hg 含量。Hg only 標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食 標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食 + Hg2+GC-Hg 標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食 + E. coli GC 標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食 + Hg2+PC-Hg 標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食 + E. coli PC 標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)食 + Hg2+
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X70

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本文編號(hào)：2682857