【摘要】：砷(As)是對植物與人類有害的一種類金屬元素,土壤砷污染主要以無機砷污染為主。植物對無機砷的吸收主要分為對五價砷[As(V)]與三價砷[As(Ⅲ)]的吸收。在好氧環(huán)境中,土壤中的無機砷主要以As(V)通過磷轉運蛋白進入植物體內。在淹水條件下,水稻根系分泌的氧氣可能氧化土壤根際的As(Ⅲ),因此也會有部分As(V)通過磷轉運蛋白被植物吸收。被植物吸收到體內的As(V)能夠迅速被還原成As(Ⅲ),As(Ⅲ)能夠通過與植物螯合素(PCs)絡合形成螯合物并被轉運到液泡貯存進行解毒,這一解毒方式顯著降低砷向地上部的運輸;被還原的As(Ⅲ)也能夠通過外排系統(tǒng)排出植物體外。在As(V)解毒過程中,植物體內As(V)向As(Ⅲ)的還原過程是影響解毒效率的重要因素。近年來,人們對多種植物體內的砷酸鹽還原酶基因進行了克隆與研究,特別對模式植物擬南芥的研究較為深入。近期研究報道顯示擬南芥AtHACl(High Arsenic Content 1)參與植物體內As(Ⅴ)向As(Ⅲ)的還原過程,沉默AtHAC1會顯著降低擬南芥對As(V)的還原能力并降低植株對As(V)的耐性,導致砷在植物地上部大量積累。而對于水稻這一重要的糧食與模式作物,我們對其體內砷酸鹽還原酶基因的功能特性了解甚少。本課題首先以擬南齊砷酸還原酶基因At也HAC1為研究對象,通過原核表達分析表明AtHAC1能夠回補大腸桿菌砷酸鹽還原酶突變體AarcC對As(V)的還原能力,提高突變體對As(Ⅴ)的耐性。對獲得的AtHAClT-DNA插入沉默突變體進行一系列生理試驗。在0-200 μM不同濃度梯度As(V)處理條件下,我們對突變體材料以及野生型植株對砷的吸收與積累進行分析研究。結果表明:AtHAC1沉默表達能顯著提高擬南芥根系與地上部對砷的積累,并且發(fā)現(xiàn)突變AtHAC1顯著降低擬南芥對As(V)的耐性。獲得主要研究結果表明AtHAC1能夠參與擬南芥體內As(V)的還原過程。通過與AtHAC1進行同源分析比對,我們從水稻中克隆出砷酸鹽還原酶基因OsHAC1;1與OsHAC1,.2,并以其作為研究對象,利用異源表達系統(tǒng)分析OsHAC1;1與OsHAC1;2的體外功能;利用qRT-PCR,GUS組織定位,原生質體亞細胞定位等技術分析OsHA與QsHAC1,2的時空表達模式;利用超表達及CRISPR/Cas9定點突變技術獲得OsHAC1;1與OsHAC1;2超表達和OsHAC1;1轉基因材料,并獲得OsHAC1;2的T-DNA插入突變體;通過qRT-PCR、PCR測序方法分析轉基因材料超表達及沉默效果;利用水培與盆栽等一系列生理實驗研究了OsHAC1;與OsHAC1;2的生物學功能,所獲得的主要研究結果如下:1.通過生物信息學分析表明水稻砷酸鹽還原酶OsHAC1;1與OsHAC1;2與擬南芥AtHAC1同源性高達80%以上。通過原核表達分析表明OsHAC1;1與OsHAC1;2能夠回補大腸桿菌砷酸鹽還原酶突變體△arcC對As(V)的還原能力,提高突變體對As(V)的耐性。qRT-PCR結果顯示OsHAC1;1與OsHAC1;2在水稻根系的表達量高于地上部,且當受到As(V)脅迫時,兩基因的表達量受到誘導顯著提高;而當受到As(III)脅迫時,兩基因的表達量降低。對兩基因的GUS轉基因材料進行分析顯示OsHAC1;1與OsHAC1;2在水稻根系與地上部均有強烈表達,且在根系表皮細胞以及中柱表達強烈。水稻原生質體亞細胞定位實驗表明OsHAC1;1與OsHAC1;2主要在細胞核與細胞質表達。2.通過水稻轉基因分別得到了OsHAC1;1、OsHAC1;2的超表達轉基因水稻材料和OsHAC1;1的CRISPR/Cas9點突變轉基因水稻材料,通過購買獲得OsHAC1;2的T-DNA插入突變體材料。通過qRT-PCR鑒定獲得目的基因超表達的陽性株系,并且通過PCR測序以及qRT-PCR鑒定獲得目的基因沉默表達的突變體株系。3.在2-20 μM不同濃度梯度As(V)處理條件下,我們對突變體材料,超表達材料以及野生型植株對砷的吸收與積累進行分析研究。結果表明:OsHAC1;1與OsHAC1;2沉默表達能顯著提高水稻根系與地上部對砷的積累,而OsHAC1;1與OsHAC1;2的超表達材料對砷的積累量較野生型植株顯著降低。4.對OsHAC1;1與OsHAC1;2的突變體材料,超表達材料以及野生型植株進行水培試驗,研究OsHAC1;1與OsHAC1;2沉默或者超表達是否影響水稻對As(V)的還原能力以及對砷的積累。結果表明:OsHAC1;1與OsHAC1;2沉默突變體中As(Ⅲ)/As(V)含量比值較野生型顯著降低,突變體材料外排As(Ⅲ)的效率較野生型顯著降低,表明沉默OsHAC1;1與OsHAC1;2的表達能降低水稻對As(V)的還原能力。OsHAC1;1與OsHAC1;2基因超表達材料中As(Ⅲ)/As(V)含量比值較野生型顯著提高,且根系As(Ⅲ)外排效率較野生型顯著提高,表明OsHAC1;1與OsHAC1;2超表達能顯著提高水稻對As(V)的還原能力,促進As(Ⅲ)外排,降低砷向地上部的轉運與積累。5.設計水培As(Ⅴ)濃度梯度試驗,研究超表達材料與野生型植株受As(Ⅴ)的毒害以及對As(V)的耐性。結果表明超表達OsHAC1;1與OsHAC1;2能夠顯著提高水稻對As(V)的耐性,增強水稻根系在高濃度As(V)脅迫環(huán)境下的生長能力。6.設計旱作以及干濕交替兩種栽培方式的盆栽試驗,對OsHAC1;與OsHAC1;2的突變體材料及其野生型植株、超表達材料以及其野生型植株在全生育期的表型以及籽粒砷含量進行研究。結果表明在旱作條件下,OsHAC1;1與OsHAC1;12基因沉默與超表達均不影響植株的生長,而OsHAC1;1突變體籽粒中總砷含量較野生型顯著提高36%左右,OsHAC1;2沉默突變體籽粒中總砷含量較野生型提高20%左右。OsHAC1;1與OsHAC1;2的超表達材料中水稻籽粒中總砷含量較野生型分別顯著降低19%-20%與15%-20%。在干濕交替的栽培條件下,沉默或者超表達OsHAC1;1與OsHAC1;2不影響水稻的生長,對籽粒中總砷含量也沒有顯著改變。為充分了解水稻體內參與砷酸鹽還原過程的基因功能,我們對前人報導的另一類砷酸鹽還原基因OsACR2;1與OsACR2;2進行了部分功能研究。結果發(fā)現(xiàn)OsACR2;1與OsACR2;2在異源表達體系中能夠回補大腸桿菌突變體△arsC對As(Ⅴ)的還原能力,但是沉默表達OsACR2;1與OsACR2;2并不顯著改變水稻對As(Ⅴ)的還原能力、As(Ⅲ)外排及植株砷的積累,表明在水稻體內OsACR2;1與OsACR2;2并不參與As(Ⅴ)向As(Ⅲ)的還原過程。綜上所述,水稻砷酸鹽還原酶OsHAC1;1與OsHAC1;2參與水稻體內As(V)向As(Ⅲ)的還原過程。超表達OsHAC1;1與OsHAC1;2能夠顯著提高水稻對As(V)的還原能力,降低砷向植株地上部的運輸,降低水稻籽粒對砷的富集。
【圖文】：

處理條件下，突變體地上部砷的積累量與野生型并沒有顯著差異（Ｍａｅｔａｌ．，２００６ｂ），這逡逑可能是由于水稻外排Ａｓ（ＩＩＩ）的運輸通道有其他蛋白參與。研究發(fā)現(xiàn)Ｌｓｉｌ主要在水稻根逡逑系的外皮層與內皮層的凱式帶外側表達（圖１－３）。以上結果說明Ｌｓｉｌ主要參與植物根逡逑系對外界環(huán)境中的Ａｓ（ＩＩＩ）的吸收與外排。Ｍａ等于２００８年在蛙卵，酵母中異源表達逡逑了邋ＯｓｉＶ／ＰｉNB邋ＯｓＷ２；２（Ｌｓｉ６）以及ＱｓｉＶ／尸３／７，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在蛙卵，酵母細胞中均能逡逑轉運Ａｓ（ＩＩＩ）（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）。在植物中研究發(fā)現(xiàn)尸人７，邐以及ＯＳＭＰ３／７逡逑在根系的表達量很低，同時水稻０ｓＮＩＰ２；２突變體對Ａｓ（ＩＩＩ）的吸收能力并沒有顯著降逡逑低。因此推測這些蛋白對Ａｓ（ＩＩＩ）向水稻根系的運輸并沒有起很大作用（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８）。逡逑Ｍａ等于２００７年從水稻中克隆出Ｓｉ的外排轉運蛋白Ｌｓｉ２（Ｍａｅｔａｌ．，２００７），不同于Ｌｓｉｌ逡逑負責Ａｓ（ｍ）從外界環(huán)境向細胞的運輸，研究發(fā)現(xiàn)Ｌｓｉ２負責Ａｓ（ＩＩＩ）從水稻根系外皮層細逡逑胞與內皮層細胞向中柱的遷移（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．

處理條件下，，突變體地上部砷的積累量與野生型并沒有顯著差異（Ｍａｅｔａｌ．，２００６ｂ），這逡逑可能是由于水稻外排Ａｓ（ＩＩＩ）的運輸通道有其他蛋白參與。研究發(fā)現(xiàn)Ｌｓｉｌ主要在水稻根逡逑系的外皮層與內皮層的凱式帶外側表達（圖１－３）。以上結果說明Ｌｓｉｌ主要參與植物根逡逑系對外界環(huán)境中的Ａｓ（ＩＩＩ）的吸收與外排。Ｍａ等于２００８年在蛙卵，酵母中異源表達逡逑了邋ＯｓｉＶ／ＰｉNB邋ＯｓＷ２；２（Ｌｓｉ６）以及ＱｓｉＶ／尸３／７，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在蛙卵，酵母細胞中均能逡逑轉運Ａｓ（ＩＩＩ）（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）。在植物中研究發(fā)現(xiàn)尸人７，邐以及ＯＳＭＰ３／７逡逑在根系的表達量很低，同時水稻０ｓＮＩＰ２；２突變體對Ａｓ（ＩＩＩ）的吸收能力并沒有顯著降逡逑低。因此推測這些蛋白對Ａｓ（ＩＩＩ）向水稻根系的運輸并沒有起很大作用（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８）。逡逑Ｍａ等于２００７年從水稻中克隆出Ｓｉ的外排轉運蛋白Ｌｓｉ２（Ｍａｅｔａｌ．，２００７），不同于Ｌｓｉｌ逡逑負責Ａｓ（ｍ）從外界環(huán)境向細胞的運輸，研究發(fā)現(xiàn)Ｌｓｉ２負責Ａｓ（ＩＩＩ）從水稻根系外皮層細逡逑胞與內皮層細胞向中柱的遷移（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．
【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X53;Q943.2

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本文編號：2675666