【摘要】：DNA損傷應(yīng)答(DDR)是多細(xì)胞生物應(yīng)對(duì)各種外源性刺激如紫外線、電離輻射、抗腫瘤藥物及內(nèi)源性生理性過程如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的重要病理生理過程。DDR是多級(jí)結(jié)構(gòu)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,包括sensors,mediators,transducers和effectors。損傷應(yīng)答的結(jié)局事件表現(xiàn)為以下情況:細(xì)胞周期停滯,受損傷的DNA分子被修復(fù);受損DNA未能正確修復(fù)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;受損DNA未能正確修復(fù)而進(jìn)入子一代細(xì)胞,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成。目前已有很多證據(jù)證明DNA損傷應(yīng)答廣泛地參與了肺部疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、急性肺損傷等的病理生理過程。炎癥是多細(xì)胞有機(jī)體針對(duì)對(duì)微生物及各種物理化學(xué)性傷害引起的免疫系統(tǒng)的最終反應(yīng)。呼吸系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)即是各種類型的急、慢性氣道炎癥。哮喘作為一種過敏性疾病,是由多種效應(yīng)細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥,同時(shí)由細(xì)胞因子、趨化因子、組胺和白三烯等組成的Th2型免疫反應(yīng)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。慢性阻塞性肺疾病的基本病理特征是由中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子如IL8、LTB4及蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶、彈性蛋白酶等長期作用形成肺氣腫和慢性支氣管炎。各種病原微生物(如LPS、細(xì)菌)、大氣顆粒物(PM)、物理損傷等引起的急性肺損傷則是中性粒細(xì)胞浸潤為主的Thl型炎癥。MRE11-RAD50-NBS1(MRN)蛋白復(fù)合體作為DDRsensor,在維持基因組穩(wěn)定性方面扮演著多重角色,包括修復(fù)DNA雙鏈斷裂(DSBs),檢查點(diǎn)活化,減數(shù)分裂期期染色體重組和端粒長度維持等。以往的研究證實(shí)MRN復(fù)合體與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。MRN復(fù)合體中RAD50的亞等位基因突變有利于腫瘤的形成。而RAD50的靶向治療增強(qiáng)了肺部鱗狀細(xì)胞癌對(duì)鉑類為基礎(chǔ)的化療方案的敏感性,這使得對(duì)于MRN復(fù)合體的研究由以往的結(jié)構(gòu)和功能探索向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。而最近的研究證實(shí)MRN復(fù)合體在炎癥調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。MRE11和RAD50通過調(diào)節(jié)STING的運(yùn)輸過程來誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)。樹突狀細(xì)胞(DC)轉(zhuǎn)染DNA病毒后,MRN復(fù)合體從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),形成RAD50依賴性的Rad50-CARD9-dsDNA復(fù)合體,然后激活NF-κB和促進(jìn)IL-lb產(chǎn)生,而RAD50條件性敲除的DC中,DNA轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)的I型干擾素產(chǎn)生明顯受到抑制。NBS1作為MRN復(fù)合體的一個(gè)蛋白亞基,對(duì)巨噬細(xì)胞正常衰老過程有著重要作用,巨噬細(xì)胞NBS1缺失后導(dǎo)致2,4-二硝基苯(DNFB)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)。DNA損傷修復(fù)應(yīng)答相關(guān)信號(hào)通路和炎癥免疫反應(yīng)兩種重要機(jī)制在疾病過程中互相調(diào)控,影響疾病的最終結(jié)局。然而以往關(guān)于DNA損傷應(yīng)答和固有免疫系統(tǒng)之間的互調(diào)機(jī)制均來源于病毒、細(xì)菌、DNA復(fù)制過程代謝產(chǎn)物等經(jīng)典的刺激。PM2.5作為公眾健康的嚴(yán)重危害因素,是一個(gè)成分復(fù)雜的混合物,那么PM2.5誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答能否調(diào)控炎癥反應(yīng)?同時(shí)氣道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為PM2.5誘導(dǎo)的肺部炎癥中兩種主要的效應(yīng)細(xì)胞,發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。然而在PM2.5誘導(dǎo)下的氣道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答在炎癥反應(yīng)過程中的作用及分子調(diào)控機(jī)制尚未明確。因此,我們利用PM2.5在體內(nèi)、體外同時(shí)干預(yù)氣道上皮和巨噬細(xì)胞來研究RAD50介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答在PM2.5誘導(dǎo)的急性炎癥中調(diào)控作用和具體機(jī)制,為PM2.5誘導(dǎo)的呼吸系統(tǒng)疾病急性加重提供潛在的治療靶點(diǎn)。第一部分:巨噬細(xì)胞中RAD50介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答在PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥中分子調(diào)控機(jī)制的研究目的:建立PM2.5干預(yù)巨噬細(xì)胞的體外感染模型和誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的動(dòng)物感染模型,探索巨噬細(xì)胞中DNA損傷應(yīng)答在PM2.5誘導(dǎo)的肺部炎癥中的作用及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法:體外PM干預(yù)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞,采用cometassay:檢測(cè)DNA斷裂,Q-PCR和ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞及其上清中炎癥因子的變化;采用Western Blot和免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞中DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路、自噬通路、cGAS-STING以及NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。體內(nèi),將8周齡的RAD50髓系特異性敲除的小鼠RAD50f/fLysmcre作為KO實(shí)驗(yàn)組,同窩生的小鼠RAD50f/f作為對(duì)照組,共分為4組,即對(duì)照NS組、對(duì)照PM組,KO-NS和KO-PM組。對(duì)照NS組和KO-NS組經(jīng)氣道滴注NS(50μl),相應(yīng)的模型組氣道滴注PM2.5(100μg/50μl)。觀察并測(cè)定各組小鼠肺灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、肺組織病理學(xué)的改變;采用ELISA法檢測(cè)BALF中炎癥因子的表達(dá),采用Q-PCR法測(cè)定肺組織中的炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)PM2.5在體外和體內(nèi)均能誘導(dǎo)了顯著的DNA損傷,同時(shí)引發(fā)了以核RPA,53BP1和γH2AX Foci點(diǎn)形成為代表的快速DNA損傷應(yīng)答�；蚯贸蛘呃靡种苿┕δ苄砸种艱NA損傷應(yīng)答傳感器MRN復(fù)合物,均能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中PM2.5引起的包括Cxcl1,Cxcl2和Ifn-γ的細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。與在體外觀察到的結(jié)果相似,具有髓系特異性敲除RAD50的小鼠顯示出較對(duì)照組更高水平的氣道炎癥,表明在炎癥期間DNA損傷應(yīng)答的保護(hù)作用。PM干預(yù)RAD50缺失的BMDM后,其NF-κB表達(dá)較對(duì)照模型組明顯增加,而小分子抑制劑抑制NF-κB后炎癥得到緩解。結(jié)論:1.體內(nèi)外模型中PM2.5均能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞DNA鏈斷裂及相應(yīng)的DNA損傷應(yīng)答;2.DNA損傷應(yīng)答sensor缺失導(dǎo)致大量堆積的未修復(fù)的損傷DNA,加重了PM誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng),而且這種調(diào)控作用可能是通過cGAS-NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的;3.DDR通路可能為PM2.5誘導(dǎo)的肺部疾病急性加重提供新的治療靶點(diǎn)。第二部分:上皮細(xì)胞中RAD50介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答在PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥中分子調(diào)控機(jī)制的初步研究目的:建立PM2.5干預(yù)氣道上皮細(xì)胞的體外感染模型和誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的動(dòng)物感染模型,初步探索氣道上皮細(xì)胞中DNA損傷應(yīng)答在PM2.5誘導(dǎo)的肺部炎癥中的作用。方法:體外PM干預(yù)氣道上皮細(xì)胞HBE和Beas2B,采用comet assay檢測(cè)DNA斷裂,Q-PCR和ELISA法檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞及其上清中炎癥因子的變化;采用Western Blot和免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞中DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。體內(nèi),利用6-8周齡的C57雄鼠,予MRE11抑制劑mirin氣道滴注2小時(shí)后,PM干預(yù)。觀察并測(cè)定各組小鼠肺灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、肺組織病理學(xué)的改變,并采用Q-PCR法測(cè)定肺組織中的炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)PM2.5在體外能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞顯著的DNA損傷,同時(shí)啟動(dòng)以核γH2AX Foci點(diǎn)形成為代表的快速DNA損傷應(yīng)答。利用mirin抑制DNA損傷應(yīng)答傳感器MRN復(fù)合物,對(duì)氣道上皮細(xì)胞中PM2.5引起的IL6,IL8和MUC5AC具有明顯的保護(hù)作用。與在體外觀察到的結(jié)果相似,體內(nèi)mirin干預(yù)后對(duì)PM誘導(dǎo)的氣道炎癥具有明顯的保護(hù)作用。結(jié)論:1.PM能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷,并啟動(dòng)DNA損傷應(yīng)答;2.氣道上皮細(xì)胞DDR sensor功能抑制可緩解PM引起的炎癥反應(yīng);
【圖文】：

圖１．３．１．１短期ＰＭ干預(yù)誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞ＤＮＡ鏈斷裂。（Ａ）體內(nèi)ＰＭ暴逡逑露不同時(shí)間后小鼠ＢＡＬＦ細(xì)胞總數(shù)結(jié)果。（Ｂ）體內(nèi)ＰＭ干預(yù)不同時(shí)間后小鼠ＢＡＬＦ逡逑中性粒細(xì)胞比例。（Ｃ）邋ＰＭ干預(yù)２天的小鼠肺組織ＴＵＮＥＬ染色結(jié)果，綠色的ｆｏｃｉ逡逑點(diǎn)表示ＤＮＡ雙鏈斷裂位點(diǎn)，藍(lán)色代表細(xì)胞核。（Ｄ）邋ＴＵＮＥＬ染色結(jié)果的定量分析。逡逑（Ｅ）肺泡巨噬細(xì)胞中ＤＮＡ鏈斷裂，紅色熒光表示巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記，綠色的ｆｏｃｉ逡逑點(diǎn)表示ＤＮＡ雙鏈斷裂位點(diǎn)，藍(lán)色代表細(xì)胞核。（＊＊Ｐ＜０．０１，邋ＮＳ：邋Ｎｏｔ邋Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）逡逑２７逡逑

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１．３．１．２邋ＰＭ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞ＤＮＡ鏈斷裂逡逑為了進(jìn)一步體外驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，我們提取了邋Ｃ５７／ＢＬ６小鼠的骨髓細(xì)胞，體外逡逑誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞（見方法學(xué)部分１．２．４．２）后，予ＰＭ１００ｕｇ／ｍＬ干預(yù)不同時(shí)間逡逑（３ｈ，６ｈ，邋１２ｈ，，邋２４ｈ）后，利用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞ＤＮＡ損傷程度，結(jié)果顯示：逡逑在體外，ＰＭ顆�？梢哉T導(dǎo)巨噬細(xì)胞ＤＮＡ鏈斷裂，且隨著時(shí)間延長，損傷有加重逡逑趨勢(shì)（圖邋１．３．１．２Ａ，邋Ｃ）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R56;X513

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本文編號(hào)：2674941