【摘要】：酚類污染物是現(xiàn)代化工業(yè)社會(huì)生產(chǎn)中的常見污染物之一,利用微生物對(duì)酚類污染物的降解是一種環(huán)境友好型的處理方法,微生物對(duì)酚類污染物脅迫的耐受機(jī)制一直是科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。研究不同微生物菌株對(duì)酚類化合物的耐受及生物降解機(jī)制,有利于對(duì)菌株進(jìn)行耐受與降解策略的改造,對(duì)于開發(fā)新的有效的酚類污染物修復(fù)技術(shù)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以篩選到的一株洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia BNS)為供試菌株,運(yùn)用傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)方法考察了菌株的生長(zhǎng)及降酚性能。構(gòu)建洋蔥伯克霍爾德菌BNS的苯酚脅迫體系,并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和蛋白組學(xué)(Label-free)技術(shù)對(duì)苯酚脅迫0 h、2 h、12 h、24 h菌株的mRNA樣品和蛋白樣品進(jìn)行測(cè)序分析,通過差異基因與差異蛋白的GO與pathway富集分析,闡明洋蔥伯克霍爾德菌BNS應(yīng)答苯酚脅迫的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平的響應(yīng)機(jī)制,并對(duì)脅迫及降解相關(guān)的關(guān)鍵酶進(jìn)行了異源表達(dá)嘗試,具體獲得了如下結(jié)果:1.洋蔥伯克霍爾德菌(B.cepacia BNS)具有較強(qiáng)的抗逆性能,在pH 4~10生長(zhǎng)良好,80℃處理30 min,菌株仍然能夠存活。菌株通過胞外木質(zhì)素過氧化物酶和胞內(nèi)漆酶對(duì)合成染料進(jìn)行脫色,同時(shí)對(duì)苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、β-萘酚都具有降解作用,菌株對(duì)苯酚的最大耐受濃度為1.5 g/L,且在低濃度下可能通過羥化途徑降解,在高濃度下可能通過羥化和羧化途徑同時(shí)進(jìn)行苯酚的代謝。2.利用mRNA-Seq對(duì)1.5 g/L苯酚脅迫下0 h、2 h、12 h、24 h的mRNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本測(cè)序,共得到7614個(gè)表達(dá)基因,5691個(gè)顯著差異表達(dá)基因。通過差異基因的GO與Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),在脅迫初期菌株主要通過降低自身的代謝活性,提高EnvZ/OmpR、外排泵、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、DNA修復(fù)蛋白、超氧化物歧化酶SOD、冷激蛋白、谷胱甘肽GSH、漆酶等功能和應(yīng)激基因的表達(dá)來增強(qiáng)對(duì)苯酚的耐受。脅迫中期碳源饑餓因子CST與苯酚代謝通路相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)明顯,外排泵、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等繼續(xù)保持高表達(dá)狀態(tài),應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。在脅迫后期,菌株處于活躍生長(zhǎng)狀態(tài),苯酚代謝速度加大,此階段苯酚降解相關(guān)酶、氧化磷酸化、分子伴侶、外膜蛋白、降解蛋白等高水平表達(dá)。菌株在不同時(shí)刻通過調(diào)控通路基因的轉(zhuǎn)錄水平來應(yīng)答苯酚的脅迫和毒害,并由初期的被動(dòng)耐受轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃诘闹鲃?dòng)降解,且主要通過β-酮己二酸途徑對(duì)苯酚進(jìn)行降解。3.對(duì)苯酚脅迫下菌株轉(zhuǎn)錄因子和小RNA(small RNA)的差異表達(dá)情況進(jìn)行了分析。獲得10個(gè)家族共計(jì)461個(gè)轉(zhuǎn)錄因子信息,并在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用,其中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子主要參與DNA損傷修復(fù)、苯酚耐受及苯酚的降解過程;AraC家族、TetR轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控外排泵的表達(dá)、滲透壓調(diào)控等作用;Sigma因子通過σ70家族基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和σ54家族調(diào)節(jié)碳氮代謝以及anti-sigma因子的作用來調(diào)控菌株對(duì)苯酚的耐受及降解;GntR家族主要調(diào)節(jié)菌體自身的生長(zhǎng)代謝和膜相關(guān)蛋白的表達(dá);MarR家族與胞內(nèi)氧化應(yīng)激的反應(yīng)相關(guān);IclR家族在原兒茶酚等芳香酚的降解調(diào)控方面具有重要作用;LuxR家族主要調(diào)控了菌株的群體感應(yīng)、生物膜及毒力因子的表達(dá);FnR家族與XylR家族蛋白調(diào)控了菌株的氧感應(yīng)壓力及有機(jī)物的代謝。另外還獲得了484個(gè)sRNA的基因信息,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控1501個(gè)mRNA,形成了16760對(duì)sRNA-mRNA靶向調(diào)控關(guān)系。通過sRNA富集分析發(fā)現(xiàn),sRNA的調(diào)控作用主要參與了運(yùn)轉(zhuǎn)RNA的乙酰化、甘油磷脂代謝、蛋白代謝與激活、磷脂酰肌醇代謝等生物過程。4.利用非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)(Label-free)技術(shù)對(duì)苯酚脅迫下的菌體蛋白表達(dá)差異進(jìn)行鑒定分析,共鑒定出3194個(gè)蛋白信息,顯著差異的蛋白有1104個(gè),其中表達(dá)差異蛋白684個(gè),有無差異蛋白420個(gè)。經(jīng)過GO功能分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)蛋白的功能主要分布在催化活性,結(jié)合功能,轉(zhuǎn)運(yùn)活性,分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控,主要參與了代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞定位、苯甲酸降解、生物調(diào)控等重要生物學(xué)過程。菌株通過調(diào)控多種功能的膜蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、應(yīng)激響應(yīng)蛋白的差異表達(dá)來提高對(duì)苯酚的耐受,通過調(diào)控苯酚β-酮己二酸途徑中的ortho支路和原兒茶酚代謝支路來降解苯酚,以減少苯酚對(duì)細(xì)胞的毒性。5.構(gòu)建了以pET32a為載體的原核表達(dá)體系,對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌BNS類漆酶進(jìn)行了大腸桿菌表達(dá),成功獲得了一個(gè)分子量為30 kDa左右的目的蛋白,此蛋白以二聚體的形式發(fā)揮活性,純化后以ABTS為底物的比活性為7.81 U/mg,Km和kcat分別為156.4μM和619.44 s~(-1),催化效率為3.96μM~(-1) s~(-1);以2,6-DMP為底物的比活性為12.3U/mg,Km和kcat分別為100.2μM和1162.22 s~(-1),催化效率為11.60μM~(-1) s~(-1),同時(shí)能對(duì)多種合成染料進(jìn)行脫色。另外,利用畢赤酵母Ppic9K載體與GS115分泌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌中兒茶酚1,2-雙加氧酶(cat12)進(jìn)行了分泌表達(dá)嘗試,在胞外成功獲得了一個(gè)分子量為35 kDa的蛋白,該蛋白以鄰苯二酚為底物時(shí)的活性為22.55U/mg。
【圖文】：

不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）在苯酚脅迫下的分子響應(yīng)（Lin2017）

產(chǎn)乙醇細(xì)菌對(duì)抑制劑的耐受及適應(yīng)機(jī)制（IbraheemandNdimba2013）
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X703
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本文編號(hào)：2655280