【摘要】：土壤重金屬污染已經(jīng)成為世界性的環(huán)境問題,土壤中過量的重金屬不僅影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì),還可以經(jīng)食物鏈危害人體的健康。提高植物重金屬耐性能夠降低由重金屬污染帶來的負面影響。目前,關(guān)于植物重金屬耐性機制的研究主要集中在根系的限制吸收作用,根系的外排作用,有機化合物的螯合作用,抗氧化系統(tǒng)以及細胞壁的固定作用等方面。木質(zhì)素是細胞壁的組成成分之一,由木質(zhì)素單體在過氧化物酶和漆酶的催化下聚合而成,木質(zhì)素的合成能夠參與植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。在本研究中,我們重點研究了 Cu脅迫下水稻木質(zhì)素合成的響應(yīng)機制,并通過在擬南芥中表達水稻漆酶基因研究其在植物重金屬耐性中的作用,具體結(jié)果如下。首先,我們對水稻幼苗進行了不同濃度及不同時間的Cu處理,并在轉(zhuǎn)錄水平和生理水平上對樣品進行了分析。分析結(jié)果顯示,Cu脅迫能顯著增強水稻根系木質(zhì)素合成途徑基因的表達,根系木質(zhì)素的含量也隨著Cu處理濃度及時間的增加而顯著升高,水稻根系伸長顯著受到Cu脅迫的抑制,Cu脅迫對木質(zhì)素單體組成(S/G)則沒有顯著影響。另一方面,Cu脅迫能夠顯著提高水稻幼苗根系可溶態(tài)、細胞壁離子結(jié)合態(tài)愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(G-POD)和漆酶(LAC)的活性,抑制細胞壁共價結(jié)合態(tài)G-POD的活性;同時,Cu脅迫能顯著提高根系細跑壁離子結(jié)合態(tài)NADH-POD的活性、H2O2和可溶性總酚的含量。以上結(jié)果表明,Cu脅迫可以通過增強木質(zhì)素聚合反應(yīng)來提高水稻根系中木質(zhì)素積累的水平。Cu脅迫能夠同時誘導(dǎo)水稻根系木質(zhì)素和過氧化氫的積累,而過氧化氫可以作為過氧化物酶的共底物參與到木質(zhì)素聚合反應(yīng)中,因此我們通過施加NADPH氧化酶抑制劑(二亞苯基碘,DPI)和H2O2清除劑(二甲基硫脲,DMTU)來檢驗Cu脅迫誘導(dǎo)的H202在木質(zhì)素生物合成中的作用。研究結(jié)果顯示,與單獨Cu處理相比,在Cu處理前添加DPI和DMTU預(yù)處理能顯著減少水稻地上部和根系的干重,降低水稻根系H202的含量以及木質(zhì)素的積累,下調(diào)水稻根系中部分木質(zhì)素生物合成途徑基因的表達;同時也能顯著降低根系細胞壁離子結(jié)合態(tài)G-POD、NADH-POD和LAC的活性,促進水稻幼苗根系中的Cu向地上部轉(zhuǎn)運;相反,外源H2O2處理在增加水稻根系內(nèi)源H202含量的同時,能顯著上調(diào)水稻根系木質(zhì)素生物合成途徑基因的表達,增加水稻根系木質(zhì)素的含量;短時間的H2O2處理能顯著提高水稻根系細胞壁G-POD、NADH-POD以及LAC的活性。以上結(jié)果表明,在水稻根系中,Cu脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的H202能夠參與調(diào)控木質(zhì)素單體的聚合反應(yīng)及木質(zhì)素的積累,而這一過程可能會影響Cu從根系向地上部的轉(zhuǎn)運。Cu脅迫能夠顯著提高水稻根系漆酶的活性,而漆酶能夠和過氧化物酶一樣參與木質(zhì)素單體的聚合反應(yīng)。我們通過施加漆酶特異抑制劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)在生理水平上初步研究了漆酶在木質(zhì)素生物合成以及水稻Cu耐性中的作用。研究結(jié)果顯示,在正常條件下,CTAB處理能顯著降低水稻根系漆酶的活性,同時,能夠顯著抑制水稻幼苗干物質(zhì)的積累、根系伸長以及木質(zhì)素的積累,提高Cu的轉(zhuǎn)運系數(shù),而在Cu脅迫下,這些效應(yīng)會進一步增強。以上結(jié)果表明,漆酶可能在水稻根系木質(zhì)素積累的過程中起著重要作用。利用生物信息學(xué)的技術(shù)和手段對水稻漆酶家族基因的分類,編碼蛋白質(zhì)的特征、相關(guān)功能的預(yù)測以及漆酶家族基因的時空表達和非生物脅迫誘導(dǎo)表達模式進行了系統(tǒng)的分析。同時,利用定量PCR檢測了 Cu、Cd脅迫下水稻根系中漆酶基因表達水平的變化。研究結(jié)果顯示,水稻漆酶屬于銅結(jié)合蛋白家族成員,大多數(shù)定位在分泌途徑,可以分為五個亞族;水稻中31個漆酶基因分布在8條染色體上,并分布于染色體的各個部位,主要在發(fā)育早期的胚乳,生長期的根和莖中表達;同時,漆酶基因的表達受到激素、鹽、干旱和重金屬脅迫的誘導(dǎo),其中OsLAC11和OsLAC30的表達在20 μM Cu處理12 h和100 μM Cd處理6 h后均達到最高水平。研究結(jié)果表明,水稻漆酶的催化位點序列比較保守,水稻漆酶基因家族成員的時空表達模式之間存在一定的差異;一些漆酶基因能夠參與對環(huán)境脅迫的響應(yīng),其中OsLAC11和OsLAC30均為重金屬(Cu和Cd)脅迫響應(yīng)基因。為了進一步研究OsLAC11和OsLAC30的生物學(xué)功能,我們首先構(gòu)建了OsLAC11和OsLAC30的原核表達載體,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行表達,對大腸桿菌的漆酶活性及重組蛋白的表達進行了檢測。隨后,構(gòu)建了 OsLAC11和OsLAC30的植物過表達載體,將其轉(zhuǎn)入擬南芥中進行表達,并對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的木質(zhì)素積累,對重金屬(Cu和Cd)的耐性和吸收進行了分析。研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)OsLAC11和OsLAC30的大腸桿菌在IPTG的誘導(dǎo)下均能表達出具有漆酶活性的蛋白。與野生型相比,轉(zhuǎn)OsLAC11擬南芥根系木質(zhì)素積累顯著增加,轉(zhuǎn)OsLAC30擬南芥根木質(zhì)素積累變化不明顯。在含Cu(50 μM)1/2 MS培養(yǎng)基上生長7天后,轉(zhuǎn)OsLAC11擬南芥根長顯著大于野生型,轉(zhuǎn)OsLAC30擬南芥根長與野生型差異不顯著;在含Cd(50 μM)1/2 MS培養(yǎng)基上生長7天后,轉(zhuǎn)OsLAC11擬南芥根長與野生型差異不顯著,轉(zhuǎn)OsLAC30擬南芥根長顯著大于野生型。在水培條件下,5 μMCu處理3天后,與野生型相比,轉(zhuǎn)OsLAC11擬南芥根系Cu含量顯著降低,地上部則沒有顯著變化;10 μM Cd處理3天后,與野生型相比,轉(zhuǎn)OsLAC30擬南芥根系、地上部Cd含量均沒有顯著變化。以上結(jié)果表明,OsLAC11可能參與催化木質(zhì)素的合成,并能夠增強擬南芥Cu耐性,減少擬南芥根系對Cu的吸收;OsLAC30能夠增強擬南芥Cd耐性,但不影響擬南芥對Cd的吸收。
【圖文】：

ＤａｌＣｏｒｓｏ等，２０１０），以上顯示出細胞壁與植物重金屬耐性之間具有重要的關(guān)聯(lián)。逡逑２．２．４．１細胞壁多糖在植物重金屬耐性中的作用逡逑植物細胞壁多糖主要包括纖維素、半纖維素和果膠（圖１－１），細胞壁多糖上的基逡逑團能夠參與對重金屬離子的固定作用，如羧基、醛基、氨基以及磷酸基等負電基團，逡逑可以通過和金屬陽離子發(fā)生各種反應(yīng)將其固定于細胞壁中，減少重金屬離子進入細胞逡逑質(zhì)。此外，細胞壁多糖成分的變化，可以改變重金屬離子的吸附量和植物細胞的生長逡逑發(fā)育，，這也是響應(yīng)重金屬脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。逡逑研究表明，在Ｃｕ耐性植物海州香薷根系當中，細胞壁及其各個組分對Ｃｕ離子具逡逑有較高的吸附和固定能力，其中纖維素和半纖維素中的羧基以及果膠中的羥基等是其逡逑主要結(jié)合位點，這也是海州香薷根系Ｃｕ耐性的重要機制（劉婷婷等，２０１４）。Ｄａｖｉｓ逡逑４逡逑

植物細胞通過增加細胞壁中多糖，蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等成分的含量，來提高其結(jié)逡逑合重金屬離子的能力，這樣就能夠使大量的有毒的金屬離子積累在細胞壁當中，避免逡逑其過多的進入原生質(zhì)體，危害細胞的生長發(fā)育（圖１－２）。此外，植物細胞還可以通過逡逑內(nèi)化作用阻止重金屬離子進入原生質(zhì)體當中（Ｋｒｚｅｓｔｏｗｓｋａ，２０１１）。逡逑３木質(zhì)素的生物合成與調(diào)控逡逑木質(zhì)素是由植物細胞中苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生的重要的次生代謝產(chǎn)物。是由３種逡逑類型的單體（紫丁香單元，愈創(chuàng)木基單元和對輕基苯基單元）聚合而成的高分子聚合逡逑物。逡逑３．１木質(zhì)素的生物合成途徑逡逑木質(zhì)素的生物合成是十分復(fù)雜的，主要分為３個過程：木質(zhì)素單體的生物合成、逡逑轉(zhuǎn)運以及聚合反應(yīng)（圖１－３）。在植物細胞質(zhì)中，由苯丙氨酸或酪氨酸在一系列酶的催逡逑化下，經(jīng)過脫l#基、羥基化、甲基化和氧化還原等過程，轉(zhuǎn)變?yōu)闉槟举|(zhì)素單體，然后逡逑經(jīng)由轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到質(zhì)外體中，在細胞壁中最終聚合成木質(zhì)素聚合物（Ｂｏｎａｗｉｔｚ等，逡逑２０１０）。木質(zhì)素的生物合成途徑可以分為苯丙q<類代謝途徑和木質(zhì)素特異合成途徑兩逡逑個階段。苯丙烷類代謝途徑在植物體內(nèi)是一個通用途徑，經(jīng)ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ和４ＣＬ邋３個逡逑酶催反應(yīng)后進入下游木質(zhì)素特異合成途徑。木質(zhì)素合成的特異途徑
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X53;S511

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