發(fā)布時間：2020-04-22 10:43

【摘要】：當發(fā)生氧化應激,細菌感染和病毒入侵等引起的內(nèi)質網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊的蛋白質的積累時,會激活未折疊蛋白反應(UPR),它作為調(diào)節(jié)系統(tǒng),幫助細胞內(nèi)質網(wǎng)恢復穩(wěn)態(tài)。作為熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)家族的重要成員,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78kDa(glucose-regulated protein 78,GRP78)可以在熱應激下顯著提高細胞存活率。最近的研究表明,GRP78的表達可以增加重金屬脅迫下的細胞活性。重金屬離子是可以在生物體中積累的重要環(huán)境污染物之一,一旦超過閾值就會產(chǎn)生毒性或致癌作用。本研究以Pb~(2+)、Hg~(2+)、Cd~(2+)三種最具代表性的重金屬離子刺激CIK(Ctenopharyngodon idellus kindey)細胞。結果表明,Pb~(2+),Hg~(2+)和Cd~(2+)脅迫下細胞活力顯著下降。隨著重金屬離子刺激時間增加或濃度增大,觀察到細胞死亡率明顯升高。其中,Hg~(2+)對細胞的毒害作用最大。在相同的脅迫條件下,Hg~(2+)導致50%的細胞死亡,Cd~(2+)和Pb~(2+)分別導致45%和35%的細胞死亡。免疫印跡(Western bloting)結果顯示,在Pb~(2+),Hg~(2+)和Cd~(2+)脅迫下,CIK細胞Ci GRP78蛋白表達水平明顯增強,這意味著CiGRP78參與了重金屬細胞毒作用。為了進一步研究Ci GRP78在細胞保護中的作用,我們設計了針對CiGRP78的siRNA并將其轉染到CIK細胞中以沉默內(nèi)源性CiGRP78。在HgCl_2孵育12小時時,敲降后的細胞活率從50%顯著降低至21%。我們的研究結果表明,CiGRP78(Ctenopharyngodon idellus glucose-regulated protein 78)在一定程度上保護細胞免受重金屬毒害。重金屬刺激會影響基本的細胞生理活動,并導致嚴重的毒理學影響。Pb~(2+)可通過蛋白質變性,改變細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和誘導細胞死亡,來激活內(nèi)質網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應激反應。作為內(nèi)質網(wǎng)駐留蛋白,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78-kDa可以減輕Pb~(2+)誘導的ER應激并增強細胞活力。在本研究中,我們對CiGRP78如何發(fā)揮其保護功能的機制做了研究。利用金屬離子親和柱洗脫法和熒光光譜分析,我們發(fā)現(xiàn)CiGRP78可分別與鈣離子,鉛離子和鎘離子形成復合物,特別是與體外鉛離子形成復合物。然而,另一種內(nèi)質網(wǎng)駐留蛋白Ci GRP94(Ctenopharyngodon idellus GRP94)卻不能與Pb~(2+)結合,表明CiGRP78和CiGRP94在調(diào)節(jié)重金屬細胞毒性中可能存在的功能分化。我們的研究結果表明,CiGRP78可能通過與Pb~(2+)的直接相互作用增加細胞對Pb~(2+)的耐受性。重金屬離子引起ER應激,并激活未折疊蛋白(unfolded protein response,UPR)反應。在哺乳動物中,未折疊蛋白反應信號通路也涉及免疫應答,包括對經(jīng)典的核轉錄因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信號通路的影響。最近的研究表明,Inhibitor of NF-κB kinaseβ(IKKβ)作為NF-κB通路中的關鍵激酶,參與UPR相關的炎癥反應,并在ER應激誘導的細胞死亡中起重要作用。然而,關于它們之間存在信號交叉的分子機制還有待闡明。在我們過去的研究中,證明了IKKβ在哺乳動物和魚類之間具有功能保守性,它也可以激活NF-κB信號通路。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質網(wǎng)應激狀態(tài)下,核中的Ctenopharyngodon idellus IKKβ(Ci IKKβ)水平升高,并且CiIKKβ可與草魚UPR信號通路中的關鍵因子CiXBP1S相互作用。CIK細胞的熒光組織化學表明Ci IKKβ和Ci XBP1S在內(nèi)質網(wǎng)應激狀態(tài)下存在共定位。此外,CIK細胞中Ci IKKβ的過表達通過調(diào)節(jié)UPR信號傳導增強了對內(nèi)質網(wǎng)應激的耐受性,并導致細胞活力的顯著增加。這些研究結果為免疫應答和內(nèi)質網(wǎng)應激之間的分子相互作用提供了新的見解。
【圖文】：

未折疊蛋白反應[1]

PERK 信號通路是細胞在感受到內(nèi)質網(wǎng)應激壓力時最初的保護機制，，它的激活對于細胞生存來說非常重要。但同時它也能誘導細胞凋亡因子DDIT3 的表達，在持續(xù)內(nèi)質網(wǎng)壓力應激狀態(tài)下，它是細胞從促存活狀態(tài)向促凋圖 1.3 PERK 信號通路Figure 1.2 PERK signal pathway
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X171.5

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本文編號：2636436