發(fā)布時間：2020-04-17 02:43

【摘要】：吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid PCA)是生物農(nóng)藥申嗪霉素的有效成分,對黃瓜和西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病、水稻紋枯病等農(nóng)作物病害具有顯著的預防效果。研究表明申嗪霉素在土壤中的半衰期約為3.5天,微生物在降解過程中起到了關鍵作用,但其降解機理尚不清楚。隨著申嗪霉素推廣使用面積的不斷擴大,其有效成分PCA在環(huán)境中的降解行為及對生態(tài)環(huán)境的影響等問題也越來越受到人們關注。另外,解析PCA的降解途徑,尤其是第一步反應可以為減緩PCA在土壤中的降解速率提供理論支持。為了研究PCA的降解特性,課題組前期研究中篩選到一株PCA降解菌株S.wittichii DP58并獲得其基因組序列信息,同時檢測到兩個降解中間產(chǎn)物:4-羥基-1-(2-羧基苯基)-2-氰基-2-氮雜環(huán)丁烯(HPAEC)和4-羥基-1-(2-羧基苯基)-2-氰基氮雜環(huán)丁烷(HPAC),但尚未找到PCA降解的初始基因。為了解析PCA的降解途徑,我們首先歸納分析了菌株DP58,B1和24株可降解多環(huán)芳烴或雜環(huán)芳烴的Sphingomonas和Sphingobium屬細菌的降解通路和核心降解通路中的加氧酶,發(fā)現(xiàn)以鄰苯二酚為關鍵中間代謝產(chǎn)物的β-酮己二酸途徑是Sphingomonas和Sphingobium中最主要的核心代謝途徑,另外,Sphingomonas和Sphingobium菌屬基因組中存在大量基因水平轉移相關的元件,且相同降解通路的基因簇組成和基因相似度存在差異,同時說明2個屬的細菌之間較多地存在著基因轉移現(xiàn)象。接著我們發(fā)現(xiàn)菌株DP58降解PCA是誘導型的。為了尋找PCA降解相關的基因,我們對菌株DP58進行了轉錄組分析。以PCA為唯一碳源時,菌株DP58的甲苯降解通路、己內(nèi)酰胺降解通路、硝基甲苯降解通路、多環(huán)芳烴降解通路和苯甲酸降解通路等異源物質代謝通路、鞭毛編碼基因發(fā)生明顯上調。環(huán)羥化雙加氧酶被認為是芳烴化合物降解的關鍵酶,我們重點分析了轉錄組中羥化雙加氧酶的表達變化,轉錄組中表達上調倍數(shù)最大的3個加氧酶編碼基因位于同一個基因簇中,該基因簇包含2對雙加氧酶(pcaA1A2,pcaB1B2)、1個電子傳遞鏈(pcaA3A4)、1個開環(huán)雙加氧酶(pcaC)、1個單加氧酶(pcaD)、1個氧化還原酶編碼基因(pcaE)和1個調控基因(pcaR)。通過基因簇的分段克隆和全細胞轉化,確認該基因簇為PCA降解的基因簇,另外發(fā)現(xiàn)pcaA1A2A3A4可能編碼PCA降解的初始雙加氧酶。通過系統(tǒng)發(fā)育分析,我們發(fā)現(xiàn)PcaA1屬于苯甲酸類降解雙加氧酶,且與鄰羥基苯甲酸水解酶相似度最高,表明PcaA1A2可能兼有PCA脫羧功能。PcaB1與氧芴、二苯并呋喃、咔唑和二苯并二惡英等雜環(huán)芳烴雙加氧酶聚類在一起,說明PcaB1B2可能在下游途徑中負責PCA中含氮雜環(huán)的開環(huán)。將基因pcaA1A2和pcaB1B2分別克隆到質粒pMD18-T中,在大腸桿菌中誘導表達后發(fā)現(xiàn)均不能轉化PCA。接著我們將pcaA1A2、pcaB1B2分別與pcaA3、pcaA4串聯(lián)克隆到達pMD18-T中,進行誘導表達和全細胞轉化,發(fā)現(xiàn)只有pcaA1A2 A3A4一起表達時才能將PCA轉化為1,2-二羥基吩嗪。以~(13)C標記的PCA為底物的轉化實驗發(fā)現(xiàn)反應液頂空中~(13)CO_2的含量明顯升高,這說明PCA 1,2-雙加氧酶催化PCA脫去的羧基形成二氧化碳而不是作為碳源被利用。以上結果說明pcaA1A2A3A4編碼PCA降解的初始雙加氧酶(命名為PCA 1,2-雙加氧酶),其功能是催化PCA脫羧和羥基化形成1,2-二羥基吩嗪。為了進一步研究PCA 1,2-雙加氧酶的催化特點和酶學特性,我們將pcaA1A2克隆到質粒pBBR2S中并轉入P.putida KT2440,將pcaA3和pcaA4克隆到pET28a(+)中并轉入E.coli BL21(DE3),分別對三個表達菌株進行誘導和目的蛋白純化。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),PcaA1A2由兩個亞基組成,其分子量約為46和17 kDa,PcaA3的分子量約為47 kDa,PcaA4的分子量約為11 kDa。體外酶促反應結果表明,PcaA1A2、PcaA3和PcaA4是轉化PCA必需蛋白,說明PCA 1,2-雙加氧酶是IV型三組份雙加氧酶。另外我們發(fā)現(xiàn)酶促反應中PcaA3可以被RedA2取代,同時P.putida KT2440含有可以供給PcaA1A2電子的電子傳遞鏈,且電子傳遞鏈蛋白與PcaA3和PcaA4的相似度小于10%。PCA 1,2-雙加氧酶可以利用NADH和NADPH為電子供體,但使用NADH為電子供體時酶催化活性是使用NADPH的20倍。FPLC分析發(fā)現(xiàn)PcaA1A2的活性蛋白分子量為190 kDa,說明該酶是α_3β_3的組成結構。對PCA 1,2雙加氧酶進行底物專一性分析發(fā)現(xiàn),PCA 1,2-雙加氧酶還可以轉化鄰羥基苯甲酸為鄰苯二酚,但不能轉化苯甲酸和2-OH-PCA。吩嗪(PHZ)是染料、藥物和發(fā)色體等物質的合成前體,工業(yè)用量巨大,其對人體膀胱和肝細胞有一定的細胞毒性,有文獻報道菌株S.yanoikuyae B1可以將吩嗪轉化為1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪,但還沒確定負責降解的相關基因。首先對菌株B1的基因組進行了測序分析,拼接B1的基因組大小為5.7 M。接著用10個非可轉移性持家基因的氨基酸序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。發(fā)現(xiàn)菌株B1與XLDN2-5的親緣關系最近。有文獻報道菌株B1中多環(huán)芳烴的加氫和羥基化由BphA1fA2fA3A4催化,因此我們將bphA1fA2fA3A4克隆到pBbB5a-RFP中以驗證其能否催化吩嗪的降解。全細胞轉化發(fā)現(xiàn)bphA1fA2fA3A4編碼的聯(lián)苯2,3雙加氧酶可以催化PHZ的加氫和羥基化,形成1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪。另外,我們發(fā)現(xiàn)1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪不穩(wěn)定,可以自發(fā)脫水形成2-OH-PHZ�？寺”磉_下游基因bphB和bphC發(fā)現(xiàn),兩個基因編碼的蛋白不能將1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪脫氫和開環(huán),說明PHZ的降解通路與蒽的降解通路不同。另外,對bphA1f敲出和回補的實驗表明bphA1fA2f是菌株B1中PHZ降解的唯一初始雙加氧酶編碼基因。本文以S.wittichii DP58和S.yanoikuyae B1為研究對象,找到了PCA和PHZ降解的初始雙加氧酶,解析了PCA 1,2雙加氧酶的組成和酶學特性,并預測和分析了PCA降解基因簇。本文的研究為后續(xù)PCA和PHZ降解通路和降解酶的研究打下良好的基礎。
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圖 1-1 典型的多環(huán)芳烴化合物和雜環(huán)芳烴化合物Figure 1-1 polycyclic aromatic hydrocarbons and heterocyclic aromatic hydrocarbons1.1.2 幾種典型多環(huán)芳烴的降解通路微生物降解多環(huán)芳烴具有快速和環(huán)境友好等特點，其降解通路有一定相似性。首先在加氧酶的作用下使苯環(huán)羥基化，形成二氫二醇的結構，在脫氫酶的催化下形成二羥基多環(huán)芳烴，羥基化后的苯環(huán)電子變的活躍，接著在開環(huán)加氧酶的作用下完成開環(huán)，開環(huán)后的化合物在水解酶或醛縮酶的作用下脫去支鏈，經(jīng)多次開環(huán)后多環(huán)芳烴被完全轉化，最終進入核心代謝通路，為菌體生長提供能量。Gao 等收集了所有多環(huán)芳烴降解的通路，對其進行整理和歸納，目前已建立生物降解數(shù)據(jù)庫(http://eawag-bbd.ethz.ch/index.html)，數(shù)據(jù)庫中包括 219 個降解通路，1503個反應，1396 種化合物，993 個酶和 543 種微生物[2]。目前研究比較清楚的多環(huán)芳烴降解通路包括聯(lián)苯、萘、芴等，多于 4 個苯環(huán)

圖 1-2 萘降解途徑Figure 1-2 Proposed catabolic pathways of naphthalene by bacteri機原料常用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和染料的生產(chǎn)，，具有一定的環(huán)芳烴，上世紀 70 年代便分離出降解聯(lián)苯的菌株 Sckia sp. B1）[3]。聯(lián)苯在聯(lián)苯雙加氧酶（BphA1fA2fA-二氫 2,3-二羥基聯(lián)苯，再經(jīng)脫氫酶催化生成 2,3-二羥
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X592


本文編號：2630355