【摘要】：吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid PCA)是生物農(nóng)藥申嗪霉素的有效成分,對(duì)黃瓜和西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病、水稻紋枯病等農(nóng)作物病害具有顯著的預(yù)防效果。研究表明申嗪霉素在土壤中的半衰期約為3.5天,微生物在降解過程中起到了關(guān)鍵作用,但其降解機(jī)理尚不清楚。隨著申嗪霉素推廣使用面積的不斷擴(kuò)大,其有效成分PCA在環(huán)境中的降解行為及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響等問題也越來越受到人們關(guān)注。另外,解析PCA的降解途徑,尤其是第一步反應(yīng)可以為減緩PCA在土壤中的降解速率提供理論支持。為了研究PCA的降解特性,課題組前期研究中篩選到一株P(guān)CA降解菌株S.wittichii DP58并獲得其基因組序列信息,同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)降解中間產(chǎn)物:4-羥基-1-(2-羧基苯基)-2-氰基-2-氮雜環(huán)丁烯(HPAEC)和4-羥基-1-(2-羧基苯基)-2-氰基氮雜環(huán)丁烷(HPAC),但尚未找到PCA降解的初始基因。為了解析PCA的降解途徑,我們首先歸納分析了菌株DP58,B1和24株可降解多環(huán)芳烴或雜環(huán)芳烴的Sphingomonas和Sphingobium屬細(xì)菌的降解通路和核心降解通路中的加氧酶,發(fā)現(xiàn)以鄰苯二酚為關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物的β-酮己二酸途徑是Sphingomonas和Sphingobium中最主要的核心代謝途徑,另外,Sphingomonas和Sphingobium菌屬基因組中存在大量基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的元件,且相同降解通路的基因簇組成和基因相似度存在差異,同時(shí)說明2個(gè)屬的細(xì)菌之間較多地存在著基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。接著我們發(fā)現(xiàn)菌株DP58降解PCA是誘導(dǎo)型的。為了尋找PCA降解相關(guān)的基因,我們對(duì)菌株DP58進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。以PCA為唯一碳源時(shí),菌株DP58的甲苯降解通路、己內(nèi)酰胺降解通路、硝基甲苯降解通路、多環(huán)芳烴降解通路和苯甲酸降解通路等異源物質(zhì)代謝通路、鞭毛編碼基因發(fā)生明顯上調(diào)。環(huán)羥化雙加氧酶被認(rèn)為是芳烴化合物降解的關(guān)鍵酶,我們重點(diǎn)分析了轉(zhuǎn)錄組中羥化雙加氧酶的表達(dá)變化,轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最大的3個(gè)加氧酶編碼基因位于同一個(gè)基因簇中,該基因簇包含2對(duì)雙加氧酶(pcaA1A2,pcaB1B2)、1個(gè)電子傳遞鏈(pcaA3A4)、1個(gè)開環(huán)雙加氧酶(pcaC)、1個(gè)單加氧酶(pcaD)、1個(gè)氧化還原酶編碼基因(pcaE)和1個(gè)調(diào)控基因(pcaR)。通過基因簇的分段克隆和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,確認(rèn)該基因簇為PCA降解的基因簇,另外發(fā)現(xiàn)pcaA1A2A3A4可能編碼PCA降解的初始雙加氧酶。通過系統(tǒng)發(fā)育分析,我們發(fā)現(xiàn)PcaA1屬于苯甲酸類降解雙加氧酶,且與鄰羥基苯甲酸水解酶相似度最高,表明PcaA1A2可能兼有PCA脫羧功能。PcaB1與氧芴、二苯并呋喃、咔唑和二苯并二惡英等雜環(huán)芳烴雙加氧酶聚類在一起,說明PcaB1B2可能在下游途徑中負(fù)責(zé)PCA中含氮雜環(huán)的開環(huán)。將基因pcaA1A2和pcaB1B2分別克隆到質(zhì)粒pMD18-T中,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)均不能轉(zhuǎn)化PCA。接著我們將pcaA1A2、pcaB1B2分別與pcaA3、pcaA4串聯(lián)克隆到達(dá)pMD18-T中,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)只有pcaA1A2 A3A4一起表達(dá)時(shí)才能將PCA轉(zhuǎn)化為1,2-二羥基吩嗪。以~(13)C標(biāo)記的PCA為底物的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液頂空中~(13)CO_2的含量明顯升高,這說明PCA 1,2-雙加氧酶催化PCA脫去的羧基形成二氧化碳而不是作為碳源被利用。以上結(jié)果說明pcaA1A2A3A4編碼PCA降解的初始雙加氧酶(命名為PCA 1,2-雙加氧酶),其功能是催化PCA脫羧和羥基化形成1,2-二羥基吩嗪。為了進(jìn)一步研究PCA 1,2-雙加氧酶的催化特點(diǎn)和酶學(xué)特性,我們將pcaA1A2克隆到質(zhì)粒pBBR2S中并轉(zhuǎn)入P.putida KT2440,將pcaA3和pcaA4克隆到pET28a(+)中并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3),分別對(duì)三個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)和目的蛋白純化。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),PcaA1A2由兩個(gè)亞基組成,其分子量約為46和17 kDa,PcaA3的分子量約為47 kDa,PcaA4的分子量約為11 kDa。體外酶促反應(yīng)結(jié)果表明,PcaA1A2、PcaA3和PcaA4是轉(zhuǎn)化PCA必需蛋白,說明PCA 1,2-雙加氧酶是IV型三組份雙加氧酶。另外我們發(fā)現(xiàn)酶促反應(yīng)中PcaA3可以被RedA2取代,同時(shí)P.putida KT2440含有可以供給PcaA1A2電子的電子傳遞鏈,且電子傳遞鏈蛋白與PcaA3和PcaA4的相似度小于10%。PCA 1,2-雙加氧酶可以利用NADH和NADPH為電子供體,但使用NADH為電子供體時(shí)酶催化活性是使用NADPH的20倍。FPLC分析發(fā)現(xiàn)PcaA1A2的活性蛋白分子量為190 kDa,說明該酶是α_3β_3的組成結(jié)構(gòu)。對(duì)PCA 1,2雙加氧酶進(jìn)行底物專一性分析發(fā)現(xiàn),PCA 1,2-雙加氧酶還可以轉(zhuǎn)化鄰羥基苯甲酸為鄰苯二酚,但不能轉(zhuǎn)化苯甲酸和2-OH-PCA。吩嗪(PHZ)是染料、藥物和發(fā)色體等物質(zhì)的合成前體,工業(yè)用量巨大,其對(duì)人體膀胱和肝細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性,有文獻(xiàn)報(bào)道菌株S.yanoikuyae B1可以將吩嗪轉(zhuǎn)化為1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪,但還沒確定負(fù)責(zé)降解的相關(guān)基因。首先對(duì)菌株B1的基因組進(jìn)行了測(cè)序分析,拼接B1的基因組大小為5.7 M。接著用10個(gè)非可轉(zhuǎn)移性持家基因的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。發(fā)現(xiàn)菌株B1與XLDN2-5的親緣關(guān)系最近。有文獻(xiàn)報(bào)道菌株B1中多環(huán)芳烴的加氫和羥基化由BphA1fA2fA3A4催化,因此我們將bphA1fA2fA3A4克隆到pBbB5a-RFP中以驗(yàn)證其能否催化吩嗪的降解。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)bphA1fA2fA3A4編碼的聯(lián)苯2,3雙加氧酶可以催化PHZ的加氫和羥基化,形成1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪。另外,我們發(fā)現(xiàn)1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪不穩(wěn)定,可以自發(fā)脫水形成2-OH-PHZ。克隆表達(dá)下游基因bphB和bphC發(fā)現(xiàn),兩個(gè)基因編碼的蛋白不能將1,2-二氫1,2-二羥基吩嗪脫氫和開環(huán),說明PHZ的降解通路與蒽的降解通路不同。另外,對(duì)bphA1f敲出和回補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)表明bphA1fA2f是菌株B1中PHZ降解的唯一初始雙加氧酶編碼基因。本文以S.wittichii DP58和S.yanoikuyae B1為研究對(duì)象,找到了PCA和PHZ降解的初始雙加氧酶,解析了PCA 1,2雙加氧酶的組成和酶學(xué)特性,并預(yù)測(cè)和分析了PCA降解基因簇。本文的研究為后續(xù)PCA和PHZ降解通路和降解酶的研究打下良好的基礎(chǔ)。
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圖 1-1 典型的多環(huán)芳烴化合物和雜環(huán)芳烴化合物Figure 1-1 polycyclic aromatic hydrocarbons and heterocyclic aromatic hydrocarbons1.1.2 幾種典型多環(huán)芳烴的降解通路微生物降解多環(huán)芳烴具有快速和環(huán)境友好等特點(diǎn)，其降解通路有一定相似性。首先在加氧酶的作用下使苯環(huán)羥基化，形成二氫二醇的結(jié)構(gòu)，在脫氫酶的催化下形成二羥基多環(huán)芳烴，羥基化后的苯環(huán)電子變的活躍，接著在開環(huán)加氧酶的作用下完成開環(huán)，開環(huán)后的化合物在水解酶或醛縮酶的作用下脫去支鏈，經(jīng)多次開環(huán)后多環(huán)芳烴被完全轉(zhuǎn)化，最終進(jìn)入核心代謝通路，為菌體生長提供能量。Gao 等收集了所有多環(huán)芳烴降解的通路，對(duì)其進(jìn)行整理和歸納，目前已建立生物降解數(shù)據(jù)庫(http://eawag-bbd.ethz.ch/index.html)，數(shù)據(jù)庫中包括 219 個(gè)降解通路，1503個(gè)反應(yīng)，1396 種化合物，993 個(gè)酶和 543 種微生物[2]。目前研究比較清楚的多環(huán)芳烴降解通路包括聯(lián)苯、萘、芴等，多于 4 個(gè)苯環(huán)

圖 1-2 萘降解途徑Figure 1-2 Proposed catabolic pathways of naphthalene by bacteri機(jī)原料常用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和染料的生產(chǎn)，，具有一定的環(huán)芳烴，上世紀(jì) 70 年代便分離出降解聯(lián)苯的菌株 Sckia sp. B1）[3]。聯(lián)苯在聯(lián)苯雙加氧酶（BphA1fA2fA-二氫 2,3-二羥基聯(lián)苯，再經(jīng)脫氫酶催化生成 2,3-二羥
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X592


本文編號(hào)：2630355