發(fā)布時間：2020-04-12 05:18

【摘要】：水體富營養(yǎng)化和藍藻水華頻繁暴發(fā)是當(dāng)前國內(nèi)外迫切關(guān)注的生態(tài)問題,藍藻水華及其次級代謝物對水生動物和人類健康安全構(gòu)成了巨大威脅,藍藻水華的防控技術(shù)成為當(dāng)前研究的熱點。銅制劑是一種經(jīng)典的除藻劑,然而關(guān)于其殺藻機理及藍藻在銅離子脅迫條件下的響應(yīng)機制有待進一步深入研究。盡管銅制劑具有除藻效率高、價格便宜等特點,但是銅離子在除藻過程中造成的二次污染問題引起人們的關(guān)注,尋找高效環(huán)保的除藻劑以控制藍藻水華顯得尤為重要。本研究以藍藻水華中最為常見的產(chǎn)毒藻株銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa,M.aeruginosa)PCC 7806和M.aeruginosa FACHB 905為研究對象,研究銅離子抑殺M.aeruginosa PCC 7806作用機制,并研究銅離子脅迫條件對M.aeruginosa PCC 7806產(chǎn)毒機能的影響;還嘗試尋找更為安全高效的除藻方法,開展了維生素C對M.aeruginosa FACHB 905的抑殺作用及其機制的研究。主要研究結(jié)果如下:1.使用不同濃度的銅離子暴露M.aeruginosa PCC 7806確定最小抑制濃度為0.5μM,銅離子對M.aeruginosa的96 h的半最大效應(yīng)濃度(Concentration for 50%of maximal effect,EC50)為3μM。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較0.5μM和3μM銅離子處理組的樣品中差異表達基因,3μM銅離子處理組相對于0.5μM銅離子處理組具有更多的差異基因,在3μM銅離子處理組中顯著差異表達的基因有1306個,而在0.5μM銅離子處理組中顯著差異表達的基因有52個。在兩個銅離子處理組中金屬轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因、鐵硫簇相關(guān)基因、熱休克蛋白(HSPs)基因以及藻毒素合成酶基因都差異表達。通過Gene Ontology consortium(GO)和KEGG對差異基因進行注釋,在3μM銅離子處理組GO聚類分析中,差異基因富集于大分子復(fù)合物、膜蛋白復(fù)合物、光合作用、類囊體、氮化合物代謝等過程。KEGG通路富集分析表明,糖酵解及糖異生、次生代謝產(chǎn)物的合成、非核糖體肽合成、硫代謝、丙酸代謝、脂肪酸生物合成和代謝、光合生物碳固定、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等途徑在兩個銅離子處理組中均差異顯著。差異表達基因的獲得為深入研究銅離子抑殺銅綠微囊藻的機理奠定了基礎(chǔ)。2.使用0.5μM和3μM銅離子暴露M.aeruginosa PCC 7806,研究了微囊藻毒素(Microcystins,MCs)水平與銅離子濃度之間的關(guān)系。結(jié)果表明,0.5μM和3μM銅離子處理M.aeruginosa細胞內(nèi)MCs含量都顯著增加。通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測定了不同處理組M.aeruginosa細胞內(nèi)的銅離子和鐵離子含量。在0.5μM和3μM銅離子處理組中每個時間點M.aeruginosa細胞內(nèi)的銅離子和鐵離子含量都顯著性上升。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示在3μM銅離子處理組中的M.aeruginosa的轉(zhuǎn)運鐵離子和硫離子的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平均受到顯著性影響。實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)顯示,在0.5μM銅離子處理組和3μM銅離子處理組中,不同暴露時間點的樣品與對照組樣品相比fur A基因、MCs合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化。通過凝膠遷移實驗,發(fā)現(xiàn)調(diào)控鐵離子吸收的Fur A通過與MCs合成酶基因mcy D的啟動子區(qū)域結(jié)合,從而調(diào)控MCs的合成。因此,本研究認(rèn)為過量的銅離子進入藻體細胞造成的鐵硫簇失衡進而導(dǎo)致Fur A含量的變化,而Fur A通過與MCs合成酶基因mcy D的啟動子區(qū)域結(jié)合,從而調(diào)控MCs的合成。3.以M.aeruginosa FACHB 905為研究對象,使用不同濃度的維生素C(0,0.12,0.6,3和6 mM)處理,發(fā)現(xiàn)隨著維生素C濃度的升高,M.aeruginosa細胞的生物量逐漸減少,并且維生素C對M.aeruginosa的最低抑菌濃度為0.6 mM。0.6 mM的維生素C處理M.aeruginosa并測定不同時間點的藻細胞內(nèi)的維生素C的含量,發(fā)現(xiàn)溶液中大量的維生素C進入藻細胞。ICP測定了上述樣品中鐵離子的含量,發(fā)現(xiàn)隨著維生素C對M.aeruginosa處理時間的延長,藻細胞內(nèi)的鐵離子含量逐漸增加。同樣檢測了0.6 mM的維生素C處理M.aeruginosa的不同時間點的藻細胞內(nèi)的亞鐵離子的含量,結(jié)果表明M.aeruginosa樣品細胞內(nèi)的亞鐵離子含量變化也顯著地從0.8倍增加至4倍。0.6 mM維生素C處理的M.aeruginosa細胞在6,12和24 h樣品的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的濃度分別顯著性增加了1.43,3.62和3.15倍。這表明,維生素C進入藻細胞內(nèi)催化M.aeruginosa細胞內(nèi)Fenton反應(yīng)發(fā)生,產(chǎn)生了大量的ROS。0.6 mM維生素C處理組與對照組相比,M.aeruginosa細胞內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量、caspase-3蛋白活性等都顯著升高,透射電鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)結(jié)果顯示隨著暴露時間的增長M.aeruginosa細胞形態(tài)破碎嚴(yán)重。以上結(jié)果表明,過量的ROS誘導(dǎo)了M.aeruginosa細胞的caspase-3蛋白活性增強,脂質(zhì)過氧化和膜變形從而導(dǎo)致M.aeruginosa的死亡。0.6 mM維生素C處理組M.aeruginosa細胞內(nèi)、外的MCs含量隨著暴露時間的增加而減少。這表明維生素C催化M.aeruginosa細胞內(nèi)Fenton反應(yīng)的發(fā)生產(chǎn)生的大量ROS,并不會使藻體產(chǎn)生以及釋放更多的MCs。
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本文編號：2624327