【摘要】：印染廢水水量大、水溫高、成分復雜等特性對現(xiàn)有的生物處理方法提出了嚴峻的挑戰(zhàn),因此尋找高效、穩(wěn)定、低成本、廣譜的印染廢水處理方案成為了當務之急。本研究旨在通過構(gòu)建染料高效降解酶的表面展示系統(tǒng),既可以解決染料跨膜運輸?shù)碾y題,又可以降低廢水處理成本,為染料降解酶的實際應用提供理論基礎(chǔ)。同時本研究通過基因組挖掘獲得了一個可以同時降解三苯甲烷和偶氮染料的還原酶,并部分闡明了其底物識別機制,對具有底物廣譜性的染料降解酶類的改造具有重要意義。論文主要研究結(jié)果如下：1)重組三苯甲烷還原酶CsTMR為同源二聚體,最適pH和溫度分別為8.5和55℃,在45℃以下處理半小時后保持穩(wěn)定,在5.0-10.0的pH范圍內(nèi)處理后可以保持其初始活性的50%以上。總體而言,該酶活性和穩(wěn)定性較好,適合作為固定化或表面展示的對象來為染料廢水的降解研究提供新的思路。2)以來自Pseudomonas boreal is的冰晶核蛋白N端(InaPb-N)作為錨定蛋白,構(gòu)建CsTMR大腸桿菌表面展示系統(tǒng)。約有85%的外源蛋白被成功展示在大腸肝菌外膜上,表面展示CsTMR對孔雀石綠的脫色速率達到了640 μmol min-1 g-1DWC。表面展示酶的穩(wěn)定性比游離純酶顯著提高,特別是長期穩(wěn)定性。在我們進一步嘗試構(gòu)建輔酶再生體系,利用InaPB-N介導的葡萄糖脫氫酶DS255表面展示系統(tǒng)時,在胞外檢測不到GDH活性,說明DS255沒有被成功展示。3)利用cotG作為分子載體構(gòu)建枯草芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng),將CsTMR和DS255成功展示在芽孢表面。與純酶相比,兩種表面展示的蛋白對pH和溫度的耐受范圍更廣,且具有更好的穩(wěn)定性。利用表面展示的CsTMR和DS255的芽孢,作為全細胞催化劑構(gòu)建輔酶再生體系,根據(jù)不同的參數(shù)得出整個體系需要較高比例的芽孢展示DS255才能夠滿足CsTMR對于NADH的需求,從而達到較高的降解速率。4)以CsTMR氨基酸序列為探針,通過數(shù)據(jù)庫挖掘,從Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93的得到一個可能編碼三苯甲烷還原酶的基因,根據(jù)其底物特異性將其命名為GtAZR。重組GtAZR在pH5.5和40℃C條件下具有最大活性,在低于65℃C的溫度下保持穩(wěn)定,同時它也具有較廣的pH耐受范圍。該酶對有機溶劑有非常高的耐受性。此外,GtAZR底物譜較廣,能同時降解三苯甲烷和偶氮類染料。GtZAR強大的穩(wěn)定性和底物廣譜性使它在處理實際混合染料廢水中有著極好的應用前景。5)通過同源建模、分子對接、分子動力學模擬和定點突變實驗,對CsTMR和GtAZR的底物識別機制進行了初步探索。研究結(jié)果顯示,GtAZR的第79、80和148位氨基酸殘基可能參與其對甲基紅的識別,而CsTMR的146位氨基酸可能與其對孔雀石綠的識別有關(guān)。本研究從結(jié)構(gòu)的角度部分闡明了GtAZR的底物識別機制,為染料降解酶類底物譜的改造提供了新的思路。
【圖文】：

示ＤＮＡ片段與唆菌體的衣殼蛋白基因融合，從而展示在睡菌體表面，通過這種方逡逑法可Ｗ構(gòu)建氋度多樣化的幢菌體突變庫，結(jié)合氋效的篩選方法獲得感興趣的突變逡逑體（圖１－４）。一般通過淘選方法篩選重組VS菌體，利用固定的抗原（底物）與表面展示逡逑１５逡逑

＼邐＼＾邋ｒ邐Ｆｌａｇｅｌｌａｒ逡逑化逡逑圖１－５革蘭氏陰性菌表面展示系統(tǒng)的常用錯定蛋白［１２２］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｓｕｒｆａｃｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｕｓｅｄ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｄｉｓｐｌａｙ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｉ打邋Ｇｒａｍ－打ｅｇａｔｉｖｅ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋［１２２］逡逑ＩＮＰ（Ｉｃｅ邋Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ）是發(fā)現(xiàn)于歐文氏菌、假單胞菌屬和黃單胞菌等植物逡逑致病菌的外膜蛋白，在過冷水中促進冰晶的形成造成植物霜害。ＩＮＰ的Ｎ末端結(jié)逡逑構(gòu)域包含Ｈ到四段跨膜區(qū)，含有疏水氨基酸并能通過糖基a愔瑧溂〈加臚餑は嗔�，，辶x希媚┒私峁褂蚋叨惹姿⒈┞隊諭獠拷櫓手�，中也部仿汓括一媳I兄馗辭蜃魑義匣誦緯傻哪０澹郟保矗玻蕁Ｑ芯糠⑾鄭桑危械鬧幸�、部分并不视H慫匭氳�，抠犔d魑溴義細艫ノ壞鶻諭庠吹鞍綴拖赴礱嫻木嗬耄筆е醒脛馗吹ピ模桑危薪囟咸逡材苡緬義嫌諼榷ǖ謀礱嬲故鞠低車墓菇�，进一步研究发相嵨末端结构域可Ｗ单独作为创墾辶x系鞍子糜諭庠吹鞍椎謀礱嬲故荊ㄍ跡保叮�。ＩＮＰ己睉褧瘭用釉忹聚糖庶糖酶、^~甲基逡逑纖維素酶、木糖脫氨酶等的展示［１４３－１＾。ＩＮＰ具有表達量大且不影響大腸桿菌生存逡逑力
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X791

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本文編號：2623911