發(fā)布時間：2020-04-01 23:06

【摘要】：重金屬對土壤和水體的污染是主要的環(huán)境問題之一。當(dāng)重金屬在生物體內(nèi)積累超過一定量時，即會對生物產(chǎn)生毒害。同時重金屬具有不可降解性，對土壤及水體的污染，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，并通過食物鏈危及人類的健康。植物體在適應(yīng)環(huán)境的過程中，逐漸形成了一系列的適應(yīng)性機制。植物細(xì)胞對重金屬毒害的耐性機理之一是合成一些配位基團(tuán)，與重金屬離子螯合，從而降低細(xì)胞質(zhì)中重金屬的自由離子活度。植物細(xì)胞中能與重金屬結(jié)合的配位基團(tuán)包括氨基酸、有機酸等小分子物質(zhì)以及金屬硫蛋白(MTS)、金屬螯合肽(PCs)等小分子量的多肽。本研究通過水培的方法研究了海州香薷(Elsholtzia haichowensis)、野草香(Elsholtzia cypriani)及香薷(Elsholtzia ciliata)三種香薷植物對銅吸收及耐性的比較，分析了銅對三種香薷種子萌發(fā)、幼苗生長及營養(yǎng)元素吸收的影響，同時從海州香薷中獲得了EhMT1基因的全長cDNA，并對EhMT1基因功能進(jìn)行了初步分析。 實驗結(jié)果表明，50μM Cu處理降低了野草香和香薷胚根及下胚軸的生長，根伸長完全受到抑制；在相同濃度的Cu處理下，海州香薷的生長沒有受到顯著抑制，且地上和根系銅濃度都顯著高于野草香和香薷。當(dāng)100μM Cu處理時，海州香薷地上部和根系的銅濃度最高可達(dá)217和13170 mg/kgDw。銅處理能夠顯著提高海州香薷葉片和根系可溶性蛋白含量，對野草香和香薷沒有顯著的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，海州香薷比野草香和香薷具有較高的耐性，蛋白可能參與了海州香薷的耐銅性。 本研究又以海州香薷為實驗材料，以5個MT基因cDNA序列(GenBank中登錄號分別為L27813、L02306、X95709、X77254、D78491)為基礎(chǔ)，設(shè)計簡并引物，運用RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從海州香薷中擴增獲得了MT基因cDNA，，序列全長為581bp，命名為EhMT1。該cDNA序列經(jīng)BLAST程序查新確認(rèn)后在GenBank中登錄，登錄號為DQ059081。EhMT1包含一個225bp的開放閱讀框，編碼74個氨基酸；同時擴增到了一段855bp的序列，經(jīng)序列比對確認(rèn)是EhMT1的基因組DNA，包含2個內(nèi)含子和3個外顯子。海州香薷金屬硫蛋白N-端和c-端各含有6個cys，這12個cys在N-端和C-端的排列分別為CXCXXXCXCXXXCXC和CXCXXXCXCXXCXC(其中X代表任意氨基酸)，這種排列結(jié)構(gòu)表明海州香薷EhMT1屬于MT1類。序列比對表明，本研究預(yù)測的EhMT1蛋白與其他植物金屬硫蛋白在核苷酸和氨基酸水平都表現(xiàn)很高的相似性，與Mimulus guttatus(玄參科溝酸漿屬植物)MT的相似性最高為75％。組織表達(dá)分析表明，EhMT1主要在根中表達(dá)，葉片中也有表達(dá)，而在莖中檢測不到該基因的表達(dá)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，Cu脅迫能夠上調(diào)EhMT1基因的表達(dá)，同時EhMT1基因還受熱激處理和氧化脅迫的誘導(dǎo)。 通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行EhMT1基因的原核表達(dá)分析。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到了約18kDa的融合蛋白。在各種脅迫處理下，轉(zhuǎn)化pET-30a-EhMT1的大腸桿菌重組子要比轉(zhuǎn)化pET-30a空載體的對照菌生長明顯旺盛。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入EhMT1基因，提高了大腸桿菌對各種非生物脅迫的耐性。構(gòu)建EhMT1基因瞬時表達(dá)載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，對GUS報告基因染色發(fā)現(xiàn)海州香薷EhMT1編碼產(chǎn)物主要定位在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這與前人報道的結(jié)果是一致的。另外，我們構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-EhMT1用于轉(zhuǎn)基因煙草，目前已獲得了EhMT1基因過量表達(dá)的煙草轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)基因煙草試管苗為材料進(jìn)行耐銅性分析，與對照相比，轉(zhuǎn)入EhMT1基因不僅提高了煙草轉(zhuǎn)基因植株對銅的耐性，而且也提高了煙草植株體內(nèi)Cu的積累。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：Q78;X173

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2611080