【摘要】：吲哚及其衍生物是焦化廢水中典型的氮雜環(huán)化合物,利用微生物法能將其轉(zhuǎn)化為靛藍(lán)、靛玉紅等常見色素,不僅能實(shí)現(xiàn)廢水中吲哚的有效處理,而且能夠合成有工業(yè)應(yīng)用價值的化合物,具有環(huán)境與經(jīng)濟(jì)的雙重效益。目前,靛藍(lán)類色素的微生物合成多數(shù)集中在純菌(野生菌或重組大腸桿菌)的研究,但分離的菌屬種類相對單一,主要為Pseudomonas屬,而有關(guān)微生物群落合成靛藍(lán)類色素的研究尚未見報道。本論文從野生菌、重組大腸桿菌以及活性污泥體系三個方面對微生物合成靛藍(lán)類色素的特性進(jìn)行研究,主要內(nèi)容如下： 針對靛藍(lán)合成菌屬資源相對匱乏的現(xiàn)狀,有必要篩選新型的菌株。分別采用萘+吲哚(G1)和苯酚+吲哚(G2)對活性污泥體系進(jìn)行馴化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同芳香化合物刺激的污泥體系均能轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán),且G1具有更好的靛藍(lán)合成能力,并從中篩選得到靛藍(lán)產(chǎn)生菌MQ。由16S rRNA基因序列分析表明菌株MQ歸屬于Comamonas屬,是一株新穎的靛藍(lán)產(chǎn)生菌。分別考察菌株MQ生長細(xì)胞和休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)的基本特性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生長細(xì)胞合成靛藍(lán)的最適吲哚濃度為50mg/L,萘濃度為200mg/L,得到的靛藍(lán)產(chǎn)量為32.2mg/L；休眠細(xì)胞合成靛藍(lán)的最適溫度為25℃,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min,菌量為OD6602.16,吲哚濃度為201mg/L,反應(yīng)體系pH為6.9,生成的靛藍(lán)為53.1mg/L。利用薄層色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)等分析手段對菌株MQ轉(zhuǎn)化吲哚合成的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明合成的藍(lán)色產(chǎn)物為靛藍(lán),并推測可能的代謝途徑：吲哚在萘雙加氧酶的催化下生成順式-吲哚-2,3-二氫二醇,后者自發(fā)脫水形成吲哚酚,兩分子吲哚酚在空氣中氧化二聚生成靛藍(lán)。 利用熱不對稱交錯PCR和同源擴(kuò)增的方法從菌株MQ的基因組DNA中成功擴(kuò)增到完整的萘雙加氧酶編碼基因,全長約為5.2kbp。對萘雙加氧酶基因進(jìn)行序列分析,結(jié)果表明其為nag型基因簇,基因排列順序?yàn)椋簄agAa-nagG-nagH-nagAb-nagAc-nagAd。將該基因?qū)氲紼scherichia coli BL21(DE3)中,構(gòu)建重組大腸桿菌ND_IND,利用SDS-PAGE分析及粗酶活性檢測表明萘雙加氧酶得到成功表達(dá)。重組大腸桿菌ND_IND能夠轉(zhuǎn)化吲哚、甲基吲哚、硝基吲哚、氯代吲哚等多種吲哚衍生物合成不同顏色的物質(zhì),利用紫外-可見全波長掃描、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)等分析手段對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明生成的主要產(chǎn)物為含有不同取代基的靛藍(lán)類色素。 考察重組大腸桿菌ND_IND轉(zhuǎn)化吲哚及色氨酸合成靛藍(lán)類色素的基本特性。以吲哚為底物時,菌株ND_IND合成靛藍(lán)的最適條件為：菌量OD6002.50,吲哚濃度300mg/L,葡萄糖濃度30g/L,反應(yīng)體系pH7.0,在此條件下靛藍(lán)產(chǎn)量為205.1mg/L。考察金屬離子以及典型焦化廢水組分對靛藍(lán)合成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分金屬離子以及喹啉對靛藍(lán)合成具有明顯的抑制作用。以色氨酸為底物時,菌株ND_IND合成靛藍(lán)類色素的最適萘雙加氧酶誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)時間點(diǎn)OD6001.20, IPTG濃度0.50mmol/L,誘導(dǎo)溫度30℃；利用表面響應(yīng)法對色氨酸培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,分別得到150.2mg/L靛藍(lán)和9.4mg/L靛玉紅；為進(jìn)一步提高靛玉紅的產(chǎn)量,在培養(yǎng)基中額外投加2-吲哚酮和靛紅,結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)1h后加入500mg/L2-吲哚酮能得到58.0mg/L靛玉紅,產(chǎn)量提高了6.2倍。 將野生菌MQ(B2)以及重組大腸桿菌ND_IND (B3)投加到活性污泥體系中,首次對活性污泥體系合成靛藍(lán)的特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,菌株強(qiáng)化組B2與B3的靛藍(lán)產(chǎn)量明顯高于對照組(B1),且B3合成的靛藍(lán)產(chǎn)量最高。采用Illumina高通量測序技術(shù)對微生物群落進(jìn)行分析,結(jié)果顯示強(qiáng)化菌MQ在污泥體系中能維持一段時間,而強(qiáng)化菌ND_IND則基本不能生存。QPCR分析顯示萘雙加氧酶基因(nagAc)在運(yùn)行初期與靛藍(lán)產(chǎn)量具有顯著的正相關(guān),表明強(qiáng)化菌在初期靛藍(lán)合成中起著重要的作用。降趨勢對應(yīng)分析和非參數(shù)檢驗(yàn)表明,三組體系的微生物群落結(jié)構(gòu)在運(yùn)行過程中發(fā)生了顯著的變化。Comamonas、Alcaligenes、Aquamicrobium和Pseudomonas是三組體系中主要的菌屬(平均豐度1%),其中典型的靛藍(lán)產(chǎn)生菌Comamonas和Pseudomonas與靛藍(lán)產(chǎn)量沒有明顯的正相關(guān),而Alcaligenes和Aquamicrobium與靛藍(lán)產(chǎn)量則存在顯著的正相關(guān),這些菌屬在靛藍(lán)合成研究中并未有相關(guān)報道,可能是新型的靛藍(lán)產(chǎn)生菌。
【圖文】：

德國BASF公司利用生命周期評價方法（LCA)對不同靛藍(lán)合成方法進(jìn)行了生態(tài)效益分析，結(jié)果如圖1.2所示EncruAconsii mption./ v'lU ? \ Materials liuhuo frmn plantsLniissMMi#C 廣\ \ ll / Iiuliuo f'niMi cliciiik'iil sMithcsiNV / \ / /V \ / \ / / Indigo from hiutechnuln^icalV* j/ \y' / pnuliictiiHi ^ Riskixik'iilial l)"l ⑶圖1.2不同靛藍(lán)合成方法的生態(tài)效益分析Fig. 1.2 Eco-efficiency analysis of different types of indigo production-3-

典型的單加氧酶如細(xì)胞色素P450單加氧酶、苯酷經(jīng)化酶、黃素單加氧酶、甲苯單加氧酶等（圖1.4);根據(jù)加氧酶組成成分的不同，這些酶可以劃分為多組分酶和單組分酶，其中萘雙加氧酶、苯酴輕化酶、甲苯單加氧酶等為多組分酶系，細(xì)胞色素P450單加氧酶、黃素單加氧酶等為單組分酶系（圖I.4)P3-39.40,42.44,65]^研究人員利用構(gòu)建的重組大腸桿菌對這些功能酶進(jìn)行外源表達(dá)，進(jìn)而用于靛藍(lán)類色素的合成，在靛藍(lán)合成機(jī)理、條件優(yōu)化等方面^u展了大量的工作。nail{55^thn DioxygenascMonooxygenaseMX): Niiphtlialeiic (li"\ygt‘iiast- IJphA: Biplienvl dioxvociu'iise l liriA: Tctraliii ilioxygcnase _I PHO: Pheiiol hydroxylase TMO: Ibluenc monooxygenase KMC): Flavin inoiiooxygeiiases ■1*450: ( ytochioiiie P45i) monooxygenascs .圖1.4典型的歐藍(lán)合成功能酶及其編碼基因簇Fig. 1.4 Typical enzymes and the corresponding gene clusters responsible for indigo production(1)萘雙加氧酶萘雙加氧酶是最早應(yīng)用于敲藍(lán)類色素合成的加氧酶。萘雙加氧酶（EC 1.14.12.12)，又名萘-1,2-雙加氧酶，是一類多組分雙加氧酶，通常包含一個NADH氧化還原酶、一個鐵氧化蛋白和一個包含活性位點(diǎn)的鐵-硫蛋白[66，，67]。萘雙加氧酶也是一類典型的Rieske型非血紅素鐵加氧酶，催化主體部分由大亞基和小亞基（又名a亞基和A亞基）構(gòu)成一個《3/?3的六聚體結(jié)構(gòu)，其中大亞基含有一個Rieske型[2Fe-2S]中心和一個非血紅素單-9-
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：X784;X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2611004