發(fā)布時間：2020-04-01 11:24

【摘要】：背景空氣環(huán)境污染問題對人類身體健康產(chǎn)生越來越多的影響,并已經(jīng)引起世界各國政府和衛(wèi)生組織關注。根據(jù)2002世界衛(wèi)生報告全世界每年約有800000人因空氣污染問題而影響壽命。不得不說,空氣污染是我們這個時代最大的殺手之一�？諝馕廴締栴}增加了人類疾病發(fā)生率和死亡率,尤其是呼吸系統(tǒng)疾病。隨著工業(yè)的快速發(fā)展和不斷飆升的能源消費,空氣污染問題在中國變得越來越嚴重,并且在經(jīng)濟發(fā)達的許多城市的空氣污染水平已經(jīng)超過了 WHO指南規(guī)定的上限。在所有空氣污染物中,最常見的是顆粒物污染物、二氧化硫和二氧化氮�？諝馕廴疚�,特別是PM對人體健康造成了相當大的危害。PM是一種廣泛存在的空氣污染物,是空氣中固體顆粒和液滴的混合物。在大城市可吸入肺顆粒物日常濃度,如北京和上�？赡苓_到峰值100-300微克/立方米,遠遠超過WHO指南規(guī)定的上限(10微克/立方米)。流行病學研究表明,PM暴露與肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)等呼吸道疾病的發(fā)病率呈正相關。PM且被發(fā)現(xiàn)可以刺激促炎性細胞因子的產(chǎn)生,加速凝血,增加內(nèi)分泌系統(tǒng)的活性,導致神經(jīng)毒性,引起過敏性致敏,激活適應性免疫反應。然而,介導PM在呼吸系統(tǒng)疾病中的分子機制仍不清楚,具體機制有待進一步明確。第一部分Egr-1在PM引起的氣道炎癥和粘液高分泌的作用及機制研究背景:PM被認為是引起人類氣道疾病的危險因素之一。然而,PM暴露與氣道損傷相關的生物學機制尚未完全闡明。目的:本研究的目的是從體內(nèi)體外實驗中探討早期生長反應基因1(Egr-1)在PM誘導的肺部炎癥和黏液的高分泌中的作用。方法:體外應用PM干預HBE細胞建立PM模型。采用Q-PCR和ELISA法檢測HBE細胞及其上清中炎癥因子和粘液的變化,采用Western Blot法檢測HBE細胞中Egr-1、NF-κB(P65 and PP65)、AP-1(P-c-Jun and P-c-Fos)和MUC5AC的蛋白表達。體內(nèi)模型中,應用PM氣道滴注Egr-1敲除小鼠,并檢測各組小鼠肺灌洗液中的細胞總數(shù)和白細胞分類計數(shù)、肺組織病理學HE染色、PAS染色和免疫組化的改變;采用Q-PCR和ELISA檢測肺組織和BALF中炎癥因子的表達;采用Q-PCR和Western Blot法測定肺組織Egr-1的表達。多環(huán)芳烴化合物干預HBE細胞,采用Q-PCR和Western Blot檢測Egr-1、炎癥和粘液的表達。結果:PM暴露能夠誘導HBE細胞和小鼠肺組織中Egr-1的表達。體外實驗特異性敲除Egr-1能降低PM誘導的IL-6,IL-8和MUC5AC的表達水平,其機制為Egr-1通過介導NF-κB調(diào)控炎癥,通過介導AP-1調(diào)控粘液高分泌。體內(nèi)PM暴露動物模型進一步證明了Egr-1敲除老鼠相比野生型小鼠表現(xiàn)了更低氣道炎癥和粘液表達。PM包含有多種成分,其中多環(huán)芳烴化合物同樣可以引起Egr-1表達,也同樣能促進氣道炎癥和粘液高分泌,體外實驗特異性敲除Egr-1能降低PAH誘導的IL-6,IL-8和MUC5AC的表達水平。結論:據(jù)我們所知,我們是首次證明了 Egr-1信號通路參與了 PM引起氣道炎癥和粘液高分泌。并且可能進一步通過NF-κB調(diào)控炎癥,通過AP-1調(diào)控粘液高分泌。PM中所含的PAHs是PM誘導的肺損傷發(fā)病機制中最重要的成分。并再次強調(diào)靶向針對Egr-1作為大氣顆粒物污染引起氣道疾病或引起慢性氣道疾病如慢阻肺、哮喘疾病加重的一種新的治療策略。第二部分壞死性凋亡在PM引起的氣道炎癥和粘液高分泌的作用及機制研究背景:壞死性凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)程序性壞死,它參與多種呼吸系統(tǒng)疾病的病理過程。然而,PM是否可以引起氣道上皮細胞發(fā)生壞死性凋亡,氣道上皮細胞發(fā)生壞死性凋亡是否在PM誘導的肺部損傷的啟到重要作用仍不是十分清楚。目的:本研究的目的是從體內(nèi)體外實驗中探討氣道上皮細胞發(fā)生壞死性凋亡在PM誘導的肺部炎癥和黏液的高分泌中的作用。方法:PM作用于HBE細胞和小鼠氣道后,氣道炎癥和粘液被評估來測定氣道損傷程度。體外應用PM干預HBE細胞建立PM模型。采用Q-PCR檢測細胞中IL-6和IL-8炎癥因子mRNA變化,Q-PCR檢測肺組織中CXCL1、CXCL2、GM-CSF和MUC5AC mRNA的表達;采用ELISA法檢測HBE細胞IL-6和IL-8炎癥因子蛋白變化,Q-PCR檢測BALF中CXCL1、CXCL2、GM-CSF蛋白的表達;采用Western Blot法檢測HBE細胞中壞死性凋亡相關蛋白(RIPKI,RIPK3,and Phospho-MLKL)、Egr-1、NF-κB(P65 and PP65)、AP-1(P-c-Jun and P-c-Fos)和MUC5AC的蛋白表達;采用流式細胞儀檢測細胞壞死和線粒體活性氧。此外,肺組織病理學HE染色、PAS染色和免疫組化也被評估。結果:我們的研究表明,PM暴露能夠誘導HBE和小鼠肺組織中壞死性凋亡的相關蛋白(RIPK1,RIPK3,and Phospho-MLKL)的表達。在HBE細胞中,應用壞死性凋亡抑制劑Nec-1和GSK'872抑制壞死性凋亡發(fā)生可以顯著降低PM誘導炎性細胞因子,如IL6和IL8和MUC5AC的表達。同樣,在PM氣道滴注的體內(nèi)模型中,凋亡抑制劑Nec-1也能夠降低小鼠氣道炎癥和粘液表達。此外,我們發(fā)現(xiàn),在HBE細胞發(fā)生壞死性凋亡受線粒體活性氧介導的Egr-1控制,進一步通過介導NF-κB調(diào)控炎癥,通過介導AP-1調(diào)控粘液高分泌。結論:壞死性凋亡在PM引起氣道炎癥和粘液高分泌中起到重要作用。強調(diào)靶向針對氣道上皮細胞發(fā)生壞死性凋亡作為大氣顆粒物污染引起氣道疾病或引起慢性氣道疾病如慢阻肺、哮喘疾病加重的一種新的治療策略。
【圖文】：

逡逑１．３．１．１邋ＢＡＬＦ總細胞及中性粒細胞變化逡逑參照實驗室之前造模方法２２，構建顆粒物ＰＭ誘導的氣道炎癥動物模型。小鼠逡逑分組為野生型對照組（Ｅｇｒ－ｌ＋／＋Ｃｏｎ）、野生型ＰＭ干預組（Ｅｇｒ－１＋／＋ＰＭ）、Ｅｇｒ－１基因逡逑缺陷對照組（Ｅｇｉ＿－ｒＡＣｏｎ）、Ｅｇｒ－１基因缺陷ＰＭ干預組（Ｅｇｒ－ｒ＾ＰＭ）。干預組濃度逡逑為２ｍｇ／ｍｌ的ＰＭ溶液５０ｕｌ連續(xù)氣道滴注十天，對照組給與等量的生理鹽水氣道滴注。逡逑最后一天滴注２４小時后處死各組老鼠。實驗結果表明ＰＭ組相比對照組，ＢＡＬＦ總逡逑細胞及中性粒細胞有明顯升高，且具有統(tǒng)計學意義。同樣，，對于Ｅｇｒ－１基因敲除ＰＭ逡逑干預小鼠，相比ＣｏｎｔｒｏｌＰＭ干預組中ＢＡＬＦ細胞總數(shù)顯著降低，中性粒細胞百分比逡逑也有減少，差異有統(tǒng)計學意義（圖１．３．１．１Ａ－Ｂ）。逡逑

圖１．３．１．２氣道滴注ＰＭ引起肺泡灌洗中性粒細胞相關的炎癥因子明顯增多，Ｅｇｒ－ｌ基因敲逡逑除小鼠可以降低ＰＭ誘導中性粒細胞相關的炎癥因子表達水平。Ａ、Ｃ、Ｅ、ＧＱ－ＰＣＲ檢測逡逑各組炎癥因子ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１在ｍＲＮＡ水平的表達。Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＨＥＬＩＳＡ法逡逑檢測各組炎癥因子ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１在蛋白水平的表達。結果顯示為平均值±標逡逑準誤？邋＊ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊ｐ邋＜邋０．０１邋ａｎｄ邋＊＊＊ｐ邋＜邋０．００１．逡逑１．３．１．３小鼠肺部病理變化逡逑小鼠分組為野生型對照俎（Ｅｇｒ－ｌ＋／＋Ｃ0ｎ）、野生型ＰＭ干預組（Ｅｇｒ－１＋／＋ＰＭ）、逡逑Ｅｇｒ－ｌ基因缺陷對照組（Ｅｇｒ－ｒ／＿Ｃｏｎ）、Ｅｇｒ－ｌ基因缺陷ＰＭ干預組（Ｅｇｒ＿ｒＡＰＭ）。逡逑最后一天滴注２４小時后處死各組老鼠。取小鼠左肺組織包埋切片行Ｈ＆Ｅ染色。逡逑顯微鏡下可見ＰＭ組相比對照組，氣道周圍有明顯的炎癥細胞浸潤并且炎癥細胞逡逑的聚集明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義。同樣，對于Ｅｇｒ－ｌ基因敲除ＰＭ干預小鼠，逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X513;R56

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本文編號：2610387