【摘要】： 海洋噬菌體是海洋生態(tài)系統(tǒng)中豐度最高的一種生物類群，它在控制原核生物的死亡率，調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)、影響微食物網(wǎng)過程以及參與海洋中碳、氮等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。由于噬菌體感染對細(xì)菌的生理生化過程具有十分重要的影響，因此對海洋中某一重要細(xì)菌類群的生態(tài)動力學(xué)過程及其生態(tài)意義進(jìn)行綜合考察與評價時，其周圍環(huán)境中大量存在的噬菌體與它們之間的相互作用也是一個不可或缺的重要考察因素。對海洋細(xì)菌與噬菌體之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究具有十分重要的生態(tài)學(xué)意義。本文選擇了兩株具有重要生態(tài)地位的海洋細(xì)菌，即好氧不產(chǎn)氧光合異養(yǎng)細(xì)菌Roseobacter denitrificans OCh114和玫瑰桿菌屬細(xì)菌Silicibacter pomeroyi DSS-3作為宿主菌，對其敏感性噬菌體進(jìn)行了分離與鑒定，并就它們與噬菌體之間的相互關(guān)系進(jìn)行了研究。 首先，我們以R.denitrificans OCh114作為宿主菌，自中國南海分離到一株烈性噬菌體RDJLΦ1，分別從電鏡形態(tài)、感染周期、宿主范圍、核酸和蛋白質(zhì)組成等方面對該噬菌體進(jìn)行了分析和鑒定。電鏡觀察顯示，該噬菌體具有一個等面體的頭部(直徑約69 nm)和一個長約170 nm、寬約9 nm的尾部，屬于病毒分類學(xué)中的長尾病毒科(Siphoviridae)噬菌體。RDJLΦ1對氯仿具有很強(qiáng)的抗性，表明該噬菌體的衣殼內(nèi)不含脂類物質(zhì)。噬菌體RDJLΦ1具有較強(qiáng)的裂解能力，短時N間內(nèi)即可引起宿主細(xì)菌的大量死亡。它感染宿主細(xì)菌時，在宿主細(xì)胞內(nèi)的潛伏期約為80min，宿主菌被裂解時，平均每個細(xì)胞約釋放203個子代噬菌體粒子。該噬菌體具有較強(qiáng)的感染專一性，在受試的24株細(xì)菌中，僅R.denitrificansOCh114能被其感染。對噬菌體RDJLΦ1的核酸進(jìn)行限制性酶切分析后，證實RDJLΦ1的基因組是一種雙鏈DNA分子，并且其基因組中存在著某種形式的修飾化堿基，，使得其對一些常見的限制性內(nèi)切酶具有抗性作用。對該噬菌體的基因組進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序后，得到了一段1，651 bp的噬菌體基因組片段，對該基因組片段序列進(jìn)行聚類分析后，發(fā)現(xiàn)噬菌體RDJLΦ1與另一株海洋噬菌體JL001具有較近的親源關(guān)系。最后，使用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF MS／MS質(zhì)譜鑒定技術(shù)對噬菌體RDJLΦ1的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行了分析與鑒定，揭示RDJLΦ1至少由12種不同的蛋白質(zhì)所組成，其中4個蛋白為其宿主同源蛋白，另外的8個蛋白由于在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中找不到其同源匹配物，被認(rèn)為是目前未知的新蛋白。以我們所知，本文中RDJLΦ1代表了第一株分離到的好氧不產(chǎn)氧光合異養(yǎng)菌(Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria，AAPB)噬菌體，為將來人們研究AAPB與其噬菌體之間的相互關(guān)系拉開了序幕。 其次，結(jié)合使用原子力顯微鏡成像技術(shù)(Atomic Force Microscopy，AFM)與比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，我們對噬菌體RDJLΦ1感染R．denitrificans OCh114的整個過程中，宿主菌的動態(tài)響應(yīng)過程及機(jī)制進(jìn)行了研究與探討。在原位狀態(tài)下，對受感染宿主菌的實時AFM成像揭示了R．denitrificans OCh114在受噬菌體感染的整個過程中其細(xì)胞表面形態(tài)的動態(tài)變化過程，尤為值得一提的是，噬菌體裂解細(xì)菌這一極其短暫的動態(tài)過程被以AFM圖片的形式追蹤記錄了下來，這也是原子力顯微鏡技術(shù)在原位實時地觀察噬菌體裂解細(xì)菌這一短暫過程中得以成功應(yīng)用的首次報道，為人們直觀的了解噬菌體感染細(xì)菌的動態(tài)過程提供了珍貴的圖片資料。另外，利用基于雙向凝膠電泳(2D-PAGE)與MALDI-OF MS／MS質(zhì)譜鑒定技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對R．denitrificans OCh114受RDJLΦ1感染后不同時間點(diǎn)(分別是受感染后的0、0．5、1．5、3和4．5 h)的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行了比較與分析，發(fā)現(xiàn)R.denitrificans OCh114受噬菌體感染后，在很短的時間(約30 min)內(nèi)即能夠完成全部的蛋白質(zhì)響應(yīng)，所需時間大大短于噬菌體RDJLΦ1在其宿主細(xì)胞內(nèi)的潛伏時間(約80 min)，對宿主細(xì)菌蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行比較分析后，發(fā)現(xiàn)約有91種蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。為了對這一響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行初步的了解，我們對部分重要的響應(yīng)蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，并對其生理功能進(jìn)行了探討。從一個新的視角出發(fā)，該研究將有助于我們對細(xì)菌與噬菌體(尤其是海洋細(xì)菌與其噬菌體)之間的相互關(guān)系進(jìn)行更加全面的了解。 在噬菌體感染原核生物細(xì)胞的過程中，一些原核生物細(xì)胞有時可以通過突變獲得對某些噬菌體的抗性，從而得以存活下來。M1是由海洋玫瑰桿菌Silicibacterpomeroyi DSS-3在噬菌體Φ1感染的強(qiáng)脅迫誘導(dǎo)作用下產(chǎn)生的一株突變體，它獲得了一種能抵抗噬菌體Φ1感染的能力。在本論文最后部分，我們對突變株M1抵抗噬菌體Φ1感染的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，逐一對以下幾種機(jī)制發(fā)生的可能性進(jìn)行了排除，它們分別是流產(chǎn)感染、吸附抑制、以及基于CRISPRs(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)的抗感染機(jī)制。最后，利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對DSS-3與其突變株M1的蛋白表達(dá)圖譜進(jìn)行比較分析后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)4種高豐度蛋白的某種翻譯后修飾可能賦予了突變株M1對噬菌體RDJLΦ1感染的抗性作用，其中的一種蛋白質(zhì)經(jīng)MALDI-FOF MS分析后，被成功鑒定為一種基于S.pomeroyi DSS-3基因組進(jìn)行注釋得到的假定蛋白(SPOA0343)。該部分的研究結(jié)果暗示了像SPOA0343這類蛋白的某種翻譯后修飾參與了細(xì)菌抵抗噬菌體感染的過程。以我們所知，這是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)引入到細(xì)菌對噬菌體感染的抗性機(jī)制研究中的首次報道，豐富了人們對細(xì)菌抵抗噬菌體感染的方式和機(jī)制的了解。
【圖文】：

兩株海洋玫瑰桿菌與其噬菌體之間相互關(guān)系的研究仍然還是處于起步階段，因此圍繞海洋噬菌體開展一系列相關(guān)的研究工作將具有十分重要的生態(tài)學(xué)意義。1.1.2海洋病毒(絕大多數(shù)為噬菌體)的發(fā)現(xiàn)、豐度及其主要類群海洋病毒的研究始于20世紀(jì)60年代，一段時期內(nèi)，人們主要是將其視為動植物的病原體來進(jìn)行關(guān)注和研究。直到20世紀(jì)90年代，人們才發(fā)現(xiàn)海水中含極其大量的浮游病毒，進(jìn)而圍繞浮游病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)中可能會行使的重要態(tài)作用開展了大量的研究工作。如今，有關(guān)海洋浮游病毒(Viri叩lankton)的究己成為海洋生態(tài)學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)之一(焦念志，2006)。

它們在生物量上僅占海洋中總生物量的5%左右。相比之下，原核生物的豐度雖僅占全部生物體的10%，但其生物量卻占據(jù)90%以上。相對于病毒和原核生物而言，原生動物是海洋中生物量最低的類群 (Suttle，2007)(圖1一1)。海洋中的浮游病毒主要包括噬菌體、噬藻體(或稱藍(lán)細(xì)菌病毒)和真核藻類病毒等。其中噬藻體在分類學(xué)上也屬于噬菌體。海水中絕大多數(shù)的病毒均為噬菌體(Fuhrman，1999:Suttle，2007)。 1.1.3海洋噬菌體的結(jié)構(gòu)特征及其分類噬菌體個體小、結(jié)構(gòu)簡單，主要由蛋白質(zhì)外殼和包裹在外殼內(nèi)的核酸所組成，少數(shù)噬菌體還含有少量的糖類或脂類物質(zhì)。每種噬菌體往往僅含有一種類型的核酸物質(zhì)，有的是DNA，有的是RNA;有的是雙鏈，有的是單鏈;有的是線狀，有的是環(huán)狀。在2005年國際病毒分類委員會發(fā)表的《病毒分類一國際病毒分類委員會第8次報告》中
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：X172

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉玲;轉(zhuǎn)Bt基因玉米對土壤微生物多樣性的影響[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號：2595751