【摘要】：重金屬鎘存在廣泛、半衰期長、危害嚴(yán)重,可在人體長期蓄積,損傷神經(jīng)系統(tǒng)、侵害心血管系統(tǒng)、抑制免疫功能、影響內(nèi)分泌系統(tǒng)、具有生殖毒性、對骨骼系統(tǒng)更深具影響,其骨骼毒性作用機(jī)理亟待進(jìn)一步深入研究和解析。體內(nèi)外研究證實(shí),鎘可引起多種細(xì)胞損傷和凋亡,且凋亡與氧化應(yīng)激、胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、線粒體損傷、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)及非Caspase依賴性通路的激活密切相關(guān)。本研究以體外培養(yǎng)的孕18d SD大鼠胎鼠成骨細(xì)胞為模型,通過體外試驗(yàn)探討了鎘對大鼠成骨細(xì)胞的毒性損傷效應(yīng)及其凋亡可能的作用機(jī)理,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)鎘的骨骼毒性作用提供依據(jù)。 1.鎘對大鼠成骨細(xì)胞的毒性損傷及NAC的保護(hù)效應(yīng) 采用二次酶消化法獲得孕18d SD大鼠胎鼠成骨細(xì)胞,經(jīng)鑒定后,用0、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10、20μmol/L的醋酸鎘染毒,通過cck-8還原法和細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)控測定0-48h內(nèi)染鎘細(xì)胞存活率、細(xì)胞指數(shù)及LDH酶活性；染毒時(shí)加入0、100、500μmol/L、1、2mmol/LNAC,研究鎘對大鼠成骨細(xì)胞的毒性損傷及NAC的保護(hù)作用,同時(shí)篩選作用濃度。 結(jié)果表明,隨著染鎘濃度的增大,成骨細(xì)胞的存活率逐漸減少,呈劑量效應(yīng)關(guān)系,且具有差異顯著性(P0.05、P0.01); LDH活性顯著或極顯著升高(P0.05、P0.01);NAC可以顯著提高細(xì)胞存活率、降低LDH釋放率(P0.05、P0.01)。表明NAC對鎘致成骨細(xì)胞毒性損傷具有一定保護(hù)作用。 2.鎘對大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和凋亡的影響及NAC的保護(hù)效應(yīng) 染鎘后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化直觀反映其損傷程度,直接影響其功能。用篩選出的作用濃度,即0、1、2、5μmol/L醋酸鎘(?)500μmol/L NAC作用于成骨細(xì)胞。使用光學(xué)顯微鏡、熒光染色、透射電鏡觀察不同濃度鎘及NAC對成骨細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響,并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,為進(jìn)一步探討鎘損傷成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。 結(jié)果表明,鎘暴露導(dǎo)致大鼠成骨細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)改變,線粒體損傷,出現(xiàn)典型凋亡特征,細(xì)胞凋亡率隨染毒劑量增大而升高,呈劑量效應(yīng)關(guān)系。NAC能有效緩解鎘引起的細(xì)胞、細(xì)胞核及線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷,但凋亡率與染毒組無顯著差異。 3.鎘致大鼠成骨細(xì)胞氧化損傷及NAC的保護(hù)效應(yīng) 在鎘誘導(dǎo)的毒性損傷中,氧化應(yīng)激起著重要作用。用0、1、2、5μmol/L醋酸鎘和500μmol/L NAC作用于成骨細(xì)胞。采用黃嘌呤氧化酶比色法,DTNB比色法測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性及谷胱甘肽(GSH)含量；用熒光染料DCFH-DA、羅丹明123檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和線粒體膜電位的變化,研究了鎘對大鼠成骨細(xì)胞的氧化損傷及NAC的作用。 結(jié)果表明,SOD活性極顯著升高(P0.01); GR活性在1μmol/L鎘作用24h時(shí)顯著升高(P0.05),隨后急劇降低(P0.01); GSH含量極顯著升高(P0.01), ROS、ΔΨm水平極顯著降低(P0.01)。表明0-5μmol/L鎘觸發(fā)了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng),機(jī)體依賴酶性和非酶性抗氧化物形成有效保護(hù)機(jī)制,清除鎘暴露所產(chǎn)生的ROS,緩解低濃度鎘對成骨細(xì)胞造成的氧化損傷。 與單獨(dú)染鎘組比較,NAC極顯著降低SOD活性(P0.01)、極顯著緩解了GR降低趨勢(P0.01)、極顯著提高GSH含量(P0.01)、極顯著緩解了ROS降低趨勢(P0.01),表明其對鎘致大鼠成骨細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。 4. Caspase途徑在鎘致大鼠成骨細(xì)胞凋亡中的作用 在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞中,半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是凋亡的重要起始者和執(zhí)行者。本研究用分光光度法檢測Caspase活性、用Caspases廣譜抑制劑Z-VAD-fmk進(jìn)行Caspase的阻斷和抑制實(shí)驗(yàn),研究鎘致成骨細(xì)胞凋亡過程中是否啟動(dòng)Caspase依賴性信號(hào)通路,為揭示Caspase途徑在鎘致大鼠成骨細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制提供依據(jù)。 結(jié)果表明,在1、2、5μmol/L醋酸鎘作用下,Caspase-3活性顯著或極顯著升高(p0.05、p0.01); Z-VAD-fink對鎘引起的細(xì)胞成活率無顯著提高作用(P0.05),且對細(xì)胞凋亡形態(tài)和數(shù)量也無顯著影響,說明在鎘致成骨細(xì)胞凋亡的過程中,Caspase途徑被激活,同時(shí)很可能啟動(dòng)了非Caspase途徑。 5.鈣離子途徑在鎘致大鼠成骨細(xì)胞凋亡中的作用 鈣穩(wěn)態(tài)失衡是細(xì)胞凋亡中的普遍現(xiàn)象。本研究在進(jìn)行成骨細(xì)胞染鎘的同時(shí)添加鈣離子抑制劑Bapta-AM,通過觀察細(xì)胞與細(xì)胞核形態(tài)變化、測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞存活率、細(xì)胞活性氧水平和線粒體膜電位,流式細(xì)胞儀測定凋亡率,探討鈣穩(wěn)態(tài)失衡對鎘引起成骨細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果顯示,鎘可致成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度極顯著升高(P0.01),而Bapta-AM能緩解染鎘細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)變化,抑制鎘引起的鈣離子濃度的升高,極顯著提高染鎘細(xì)胞存活率、ROS水平和線粒體膜電位(P0.01),降低細(xì)胞凋亡率,從而在一定程度上阻斷凋亡過程,證實(shí)Ca2+超載是引起成骨細(xì)胞凋亡的重要原因。 6. MAPK途徑在鎘致大鼠成骨細(xì)胞凋亡中的作用 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介導(dǎo)胞外刺激到胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),通過轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達(dá)水平,參與細(xì)胞凋亡、增殖等多種過程。本研究在染鎘成骨細(xì)胞中添加MAPK各通路關(guān)鍵蛋白抑制劑SB202190、SP600125和U0126,通過免疫印跡測定其磷酸化情況,探討MAPK途徑在鎘致大鼠成骨細(xì)胞凋亡中的作用。 結(jié)果顯示,鎘可致ERK、p38MAPK磷酸化水平升高,JNK磷酸化水平降低；p38和ERK的抑制劑都能有效的阻止鎘引起的p-p38和p-ERK表達(dá)升高,而JNK的抑制劑不能抑制鎘引起的p-JNK表達(dá)的降低。說明鎘可激活大鼠成骨細(xì)胞MAPK信號(hào)通路,其中ERK、p38MAPK可能發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用,而JNK發(fā)揮相反作用。 7.鎘對大鼠成骨細(xì)胞RANKL/OPG的影響 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是骨代謝過程中的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路。多數(shù)因子和激素通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG控制骨形成與骨吸收。本研究通過免疫印跡法測定了0-5μmol/L鎘對成骨細(xì)胞OPG. RANKL蛋白表達(dá)水平的影響,探討其在骨代謝過程中的作用。 結(jié)果表明,鎘可致大鼠胎鼠成骨細(xì)胞RANKL/OPG比值降低,提示鎘可通過阻斷RANK與RANKL結(jié)合來抑制破骨細(xì)胞的分化,從而抑制大鼠胎鼠的骨吸收作用。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X503.22;S859.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2589496