【摘要】：養(yǎng)殖池塘水體和底泥的特征微生物群落與其棲息的生態(tài)位的環(huán)境條件相適應(yīng),并且行使特殊的生態(tài)功能。研究微生物群落結(jié)構(gòu)和他們的生態(tài)功能可以幫助我們理解池塘不同營(yíng)養(yǎng)鹽的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程和它們?cè)谠坏年P(guān)聯(lián)。由于有大量的外來(lái)有機(jī)碳(C)和有機(jī)氮(N)輸入,C和N營(yíng)養(yǎng)循環(huán)在池塘生態(tài)系統(tǒng)中尤其重要。為了更好地理解池塘中N素的地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程,降低氮污染物對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象的危害,調(diào)控氮素更多地流向水產(chǎn)品,我們調(diào)查了池塘C、N循環(huán)代謝通路及其功能微生物結(jié)構(gòu)特征,分析了C、N代謝通路相互關(guān)聯(lián)性,探索了有機(jī)碳源對(duì)生物絮團(tuán)降氮作用的影響機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.本研究使用宏基因組技術(shù)檢測(cè)了華中地區(qū)經(jīng)典草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)養(yǎng)殖池塘表層水體(surface water,SW)、底層水體(bottom water,BW)、表層底泥(surface sediment,SS)和深層底泥(deep sediment,DS)微生物群落特征和功能�？傮w上,池塘水層的群落結(jié)構(gòu)和微生物過(guò)程與SS和DS有顯著差異,Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria和Planctomycetes在池塘水體更豐富,而Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Euryarchaeota(Archaea)和Nitrospirae在底泥中含量更高(P0.05)。我們?cè)陔娔X中重建了功能潛力和N營(yíng)養(yǎng)循環(huán)代表微生物。池塘水體較高的N同化、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖功能潛力可能為監(jiān)測(cè)到的低氨氮濃度負(fù)責(zé)。氨氧化功能基因豐度非常低,并且主要在水層發(fā)現(xiàn)與Nitrosomonas(100%)相關(guān)。反硝化主要在SS中發(fā)現(xiàn),涉及的主要物種是Rhodocyclales。N固定(nif基因)和硝酸鹽異化還原成銨的功能潛力也主要在底泥中被發(fā)現(xiàn),它們對(duì)于池塘生態(tài)系統(tǒng)的氨減少是不利的�？傮w上,這些結(jié)果為養(yǎng)殖池塘的微生物功能生態(tài)提供了更加詳細(xì)的圖景。2.使用宏基因組技術(shù)分析了養(yǎng)殖池塘C營(yíng)養(yǎng)循環(huán)相關(guān)的功能潛力及其功能微生物。相對(duì)于自養(yǎng)光合生物Cyanobacteria和Cryptophyta,異養(yǎng)細(xì)菌Actinobacteria和Betaproteobacteria是池塘進(jìn)行呼吸作用的主要微生物。底泥中的CO_2還原產(chǎn)甲烷菌Methanomicrobiales和硫還原細(xì)菌Syntrophobacterales的化能合成作用是池塘主要的碳固定過(guò)程。由于游離氨對(duì)產(chǎn)甲烷菌的選擇抑制,氫營(yíng)養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌Methanomicrobiales是池塘底泥主要的產(chǎn)甲烷微生物。在池塘水層,AOB(Nitrosomonadaceae)通過(guò)氧化途徑,Ⅰ型嗜甲烷菌Methylococcaceae通過(guò)RuMP途徑,Ⅱ型嗜甲烷菌Methylocystaceae通過(guò)絲氨酸途徑利用CH_4。此外,本研究暗示外源有機(jī)碳的呼吸作用可能為池塘異養(yǎng)細(xì)菌的N同化作用和反硝化作用提供能量,Nitrosomonadales在池塘水體中扮演多種角色,不僅僅進(jìn)行硝化作用也進(jìn)行N礦化和甲烷氧化過(guò)程,Methanomicrobiales是池塘底泥主要的產(chǎn)甲烷、CO_2固定和N_2固定微生物。這些結(jié)果表明,池塘底泥氨氮的積累影響產(chǎn)甲烷過(guò)程,反過(guò)來(lái)有機(jī)碳及甲烷循環(huán)過(guò)程對(duì)氮循環(huán)過(guò)程也有顯著影響。3.在得到養(yǎng)殖水體中有機(jī)碳源可以通過(guò)多種途徑影響氮循環(huán)過(guò)程后,我們?cè)趹?yīng)用生物絮團(tuán)技術(shù)的零水體交換養(yǎng)殖桶中研究了不同碳源對(duì)微生物多樣性的影響。本實(shí)驗(yàn)包含對(duì)照組和使用不同碳源的三種生物絮團(tuán)系統(tǒng),分別是木薯粉(tapioca starch,TS)處理組,植物纖維素(plant cellulose,PC)處理組,和木薯粉、植物纖維素混合(TS+PC)處理組,實(shí)驗(yàn)在12個(gè)300 L的圓形纖維加強(qiáng)塑料桶中進(jìn)行了42天,平均體重38.1±5.9 g的黃顙魚(yú)(Pelteobagrus vachelli)共72尾被隨機(jī)分配到12個(gè)養(yǎng)殖桶中。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增的16S rRNA基因片段進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序,我們研究了所有實(shí)驗(yàn)組的總細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌的群落特征。結(jié)果表明對(duì)照組的氨氮濃度為3.6±4.6 mg/L,顯著高于TS處理組(2.4±2.9 mg/L),PC處理組(1.8±2.4 mg/L)和TS+PC處理組(2.2±2.5 mg/L)(P0.05)。TS處理組的增重率顯著高于對(duì)照組(P0.05),而PC和TS+PC處理組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P0.05)。Illumina Mi Seq測(cè)序結(jié)果表明添加植物纖維素的生物絮團(tuán)處理組(PC和TS+PC處理組)總細(xì)菌多樣性和細(xì)菌豐度顯著高于對(duì)照組和TS處理組(P0.05)。對(duì)照組和TS處理組的Betaproteobacteria顯著增高,而添加植物纖維素的處理組Alphaproteobacteria更高(P0.05)。Illumina測(cè)序分析氨氧化細(xì)菌同樣檢測(cè)到相對(duì)于對(duì)照組(Shannon index=0.84;Simpson index=0.6149),生物絮團(tuán)處理組有更高的群落多樣性(Shannon index1.21;Simpson index0.3949)。綜上所述,生物絮團(tuán)系統(tǒng)中的額外有機(jī)碳源可以減少氨氮濃度和提高總細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌的群落多樣性。4.為了更加細(xì)致的了解生物絮團(tuán)系統(tǒng)中,有機(jī)碳源添加對(duì)水體微生物群落的影響。我們?cè)诨旌戏N群的懸浮生長(zhǎng)反應(yīng)器中調(diào)查了生長(zhǎng)階段(growth period,GP)和維持階段(maintenance period,MP)細(xì)菌群落組成伴隨時(shí)間的演化過(guò)程。進(jìn)一步的在處理階段(treatment period,TP)檢測(cè)了不同碳氮比率(C/N)的合成污水輸入液對(duì)硝化細(xì)菌和潛在氨氧化速率的影響。結(jié)果表明,在10天的初始培育后,所有的生物絮團(tuán)反應(yīng)器(biofloc reactor,BR)系統(tǒng)都顯示了非常高的氨氮(NH_4~+-N)移除效率(95%)�？傮w上,通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序從18個(gè)樣品中獲得了1 191895條有效序列(平均長(zhǎng)418 bp)。PCA分析表明,接種的池塘水體(S0)與BR中的細(xì)菌群落明顯分離,同時(shí),S0中的細(xì)菌α多樣性顯著低于BR。在GP,絕大部分顯著增加的細(xì)菌是異養(yǎng)菌,包括許多有氧反硝化細(xì)菌,例如,Zoogloea,Rhodobacter,Pseudomonas,Methyloversatilis和Terrimonas。在GP中,自養(yǎng)硝化細(xì)菌也顯著積累并導(dǎo)致硝酸鹽氮(NO_3~--N)在第28天達(dá)到峰值。在MP,有氧或兼性有氧反硝化細(xì)菌,主要是Rhodobacter,Hydrogenphaga和Sphaerotilus顯著增加,并作為補(bǔ)充來(lái)移除增加的NO_3~--N。不同碳氮比率實(shí)驗(yàn)表明,Rhodobacter,Hydrogenphaga和Sphaerotilus與有機(jī)碳呈正相關(guān),而自養(yǎng)硝化細(xì)菌與有機(jī)碳呈負(fù)相關(guān)。高C/N(20:1)處理組的潛在氨氧化速率顯著高于低C/N(2:1)處理組,暗示了BR中可能存在Pseudomonas的異養(yǎng)硝化作用。我們的結(jié)果表明,有氧反硝化作用在生物絮團(tuán)反應(yīng)器的氮移除過(guò)程中扮演重要角色。
【圖文】：

圖 2-1 實(shí)驗(yàn)池塘水層垂直剖面的理化數(shù)據(jù)。理化數(shù)據(jù)的誤差線代表 6 個(gè)重復(fù)樣本的標(biāo)準(zhǔn)差。縮寫(xiě)：ORP，氧化還原電位。表層水體 (深度 0.3 m) 是有氧的 (> 5.0 mg/L)，而底層水體 (深度 1.7 m) 是缺氧的 (1.0- 3.0 mg/L)。Fig. 2-1 Vertical profiles of physicochemical data in the water columns of the experimental pond.The error bars for the physicochemical data represents the standard deviation of six replicates.Abbreviation: ORP, Oxidation-Reduction Potential. The surface water (0.3 m depth) is hyperoxic (> 5.0 mg/L), whilethe bottom water (1.7 m depth) is hypoxic (1.0 - 3.0 mg/L).2.2.2 樣本采集本研究中，，池塘表層水體 (surface water, SW；深度 0.2 - 0.4 m) 和底層水體(bottom water, BW；深度 1.6 - 1.8 m) 的水樣 (各 2 個(gè)重復(fù)) 保存在 10-L 的塑料廣口

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA完整性
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：X172

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4 李曄;章e

本文編號(hào)：2589453