發(fā)布時(shí)間：2018-02-23 04:18

  本文關(guān)鍵詞： RP4質(zhì)粒 氨氧化菌 序批式反應(yīng)器 硝化效率 基因表達(dá)　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：抗生素耐藥問題嚴(yán)重威脅著人類的健康。水環(huán)境中的抗生素抗性基因(Antibiotic resistant genes,ARGs)種類和數(shù)量的增多,對(duì)環(huán)境和人類健康均造成了一定影響。目前ARGs已經(jīng)被定義為一種新的環(huán)境污染物。污水中同樣含有大量的ARGs,而污水生物處理系統(tǒng)不僅是抗生素進(jìn)入環(huán)境的一個(gè)重要途徑,同時(shí)也是耐藥細(xì)菌、ARGs富集,并在環(huán)境中散播的一個(gè)重要污染源。污水處理過程中,生物脫氮有著重要的意義。這一過程先由氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)將氨氧化為亞硝酸鹽,再由亞硝酸鹽氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。ARGs作為生物大分子,有可能直接參與細(xì)菌的代謝進(jìn)而影響污水生物處理系統(tǒng)的污染物去除效率。本研究在課題組前期針對(duì)RP4質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移影響膜生物反應(yīng)器(Membrane bioreactor,MBR)和顆粒污泥生物反應(yīng)器(Granular sludge bioreactor,GSBR)硝化效率的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入探討RP4質(zhì)粒與AOB間水平轉(zhuǎn)移及其對(duì)AOB代謝影響的分子機(jī)制。研究擬構(gòu)建平行運(yùn)行的,以硝化反應(yīng)為主體的序批式反應(yīng)器(Sequencing batch reactor,SBR),按照析因設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)要求對(duì)不同反應(yīng)器施加不同干預(yù),觀察氨氮降解,亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮生成,總混合液懸浮固體(Mixed liquor suspended solids,MLSS)及出水SS(Suspended solids)的變化情況,并通過分子生物學(xué)方法研究RP4質(zhì)粒對(duì)AOB的影響機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共構(gòu)建了4個(gè)SBR,其中水力停留時(shí)間(Hydraulic retention time,HRT)為7.2小時(shí)。經(jīng)過馴化調(diào)整后,SBR繼續(xù)平穩(wěn)運(yùn)行約150天。正常運(yùn)行過程中,氨氮在運(yùn)行周期90 min內(nèi)基本去除完全,亞硝酸鹽氮在120 min時(shí)基本氧化完成,反應(yīng)周期末硝酸鹽氮增加量等于初始的氨氮含量。四個(gè)SBR平均總MLSS約1235±55.146 mg/L,平均出水SS約為24.95±0.91 mg/m L,SV30約為24%。實(shí)驗(yàn)同時(shí)分離純化了一株AOB,經(jīng)測(cè)序鑒定為Nitrosomonas europaea。對(duì)4個(gè)SBR施加的干預(yù)為:A反應(yīng)器投加不攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌;B反應(yīng)器投加攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌;C反應(yīng)器投加RP4質(zhì)粒;D反應(yīng)器作為空白對(duì)照。干預(yù)前持續(xù)記錄7天數(shù)據(jù);干預(yù)過程持續(xù)7天;干預(yù)結(jié)束后持續(xù)觀察14天,全程共計(jì)28天。觀察的指標(biāo)有氨氮降解,亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮生成情況,總MLSS及出水SS的變化情況。實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)提取污泥樣本,進(jìn)行總DNA、總RNA的提取和RNA反轉(zhuǎn)錄的操作;并在SBR運(yùn)行的第5個(gè)周期末對(duì)前一天投加供體菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。研究結(jié)果表明,僅投加攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌的B反應(yīng)器出現(xiàn)了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化(P0.05)。且該反應(yīng)器投加供體菌后氨氮去除率即明顯降低(P0.05),停止投菌后未恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)第21天,氨氮去除率降低至70%,然后開始恢復(fù),第25天上升至99%以上。由此可知RP4質(zhì)粒的存在降低了反應(yīng)器的氨氧化效率,且影響可持續(xù)一定時(shí)間。針對(duì)B反應(yīng)器,亞硝酸鹽氮的生成速率在第20天出現(xiàn)了降低,峰值濃度由約3.0mg/L降低至約1.7mg/L。同時(shí)硝酸鹽氮生成減少,第20天時(shí)硝酸鹽氮終濃度由約42mg/L降低至40mg/L,但單位時(shí)間內(nèi)生成速率并無(wú)明顯變化�？梢奟P4質(zhì)粒的存在未影響反應(yīng)器的亞硝酸鹽氧化效率,亞硝酸鹽氮并未出現(xiàn)累積�，F(xiàn)已知的亞硝酸鹽氮清除時(shí)間延長(zhǎng)和周期末硝酸鹽氮濃度降低更有可能是由于氨氧化受抑制而導(dǎo)致的。B反應(yīng)器的出水SS出現(xiàn)了上升的趨勢(shì)(P0.05),且出水SS最高值約達(dá)35mg/L。至第14天停止投菌后出水SS仍未恢復(fù)。直至后期第21天左右時(shí),出水SS逐漸恢復(fù)。此后的出水SS平均水平降低至25mg/L水平�？侻LSS至第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后降低至約800 mg/L(P0.05)。研究發(fā)現(xiàn)投加攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌對(duì)SBR造成影響是由于RP4質(zhì)粒與AOB接合轉(zhuǎn)移造成的,單純的供體菌和游離的RP4質(zhì)粒并不能產(chǎn)生較大影響。研究進(jìn)一步通過所獲得的DNA,cDNA,結(jié)合供體菌數(shù)量變化,研究RP4質(zhì)粒對(duì)AOB的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析。變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)結(jié)合條帶測(cè)序顯示反應(yīng)器運(yùn)行初始階段AOB主要為Nitrosomonas和βproteobacterium菌屬,均為不可培養(yǎng)細(xì)菌。整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段主要優(yōu)勢(shì)菌群并未發(fā)生明顯變化;H指數(shù)在投菌前后也未發(fā)生明顯改變(P0.05)。說明RP4質(zhì)粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群結(jié)構(gòu)改變?cè)斐傻摹３掷m(xù)投加供體菌時(shí),供體菌數(shù)量穩(wěn)定在105 cfu/mL。停止投菌后供體菌數(shù)量進(jìn)行性下降,截止第28天,出水中仍能檢測(cè)到102 cfu/mL的供體菌。熒光定量PCR測(cè)定AOB,RP4質(zhì)粒和總細(xì)菌的數(shù)量變化。結(jié)果顯示,在投加供體菌之前,AOB與總細(xì)菌的比值約為10-4。投加供體菌的過程中,AOB與細(xì)菌的比值依舊保持穩(wěn)定。投加供體菌結(jié)束后,從第20天開始,AOB與總細(xì)菌的比值出現(xiàn)了一定升高(P0.05)。在投加供體菌之前,RP4質(zhì)粒與總細(xì)菌的比值約為10-7。投加供體菌之后,比值迅速升高,達(dá)到10-2,并在投菌過程中基本維持在這一水平。投加供體菌結(jié)束之后,RP4與總細(xì)菌的比值出現(xiàn)一定的下降,但程度并不明顯,至第28天時(shí)比值仍大于10-5,提示了RP4質(zhì)粒與AOB等反應(yīng)器內(nèi)原有的微生物之間發(fā)生了接合轉(zhuǎn)移。通過AOB探針、RP4探針和總細(xì)菌核酸染料DAPI進(jìn)行的熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)提示了氨氧化菌和RP4質(zhì)粒的共定位關(guān)系,即質(zhì)粒位于氨氧化菌細(xì)胞內(nèi)。說明了RP4質(zhì)粒在活性污泥中發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移。同時(shí)純培養(yǎng)AOB,不攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌和未投加供體菌的活性污泥的三個(gè)對(duì)照組中并沒發(fā)現(xiàn)熒光共定位的現(xiàn)象。這表明RP4質(zhì)粒與包括AOB在內(nèi)的污泥中微生物的接合轉(zhuǎn)移,即異養(yǎng)菌(供體菌)向自養(yǎng)菌(受體菌)的接合轉(zhuǎn)移,是可以在SBR正常運(yùn)行過程中實(shí)現(xiàn)的。由cDNA通過熒光定量PCR得到的amoA基因和hao基因表達(dá)情況的數(shù)據(jù)繪制成熱圖(heatmap),發(fā)現(xiàn)僅投加攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌的B反應(yīng)器中AOB的amoA基因和hao基因的轉(zhuǎn)錄有所增加。停止投菌(第14天)后,轉(zhuǎn)錄依然處于較高水平。至第28天時(shí),amoA基因和hao基因的轉(zhuǎn)錄未明顯下調(diào)。RP4質(zhì)粒在AOB中發(fā)生接合轉(zhuǎn)移進(jìn)而上調(diào)amoA基因和hao基因的轉(zhuǎn)錄,這有可能是AMO等相關(guān)酶數(shù)量或(和)功能不足導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)。綜合以上結(jié)果:(1)構(gòu)建了平行運(yùn)行硝化反應(yīng)器系統(tǒng)(SBR),并分離純化出一株AOB,經(jīng)鑒定為Nitrosomonas europaea。(2)研究證實(shí)了在SBR系統(tǒng)中,RP4質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移可通過供體菌(異養(yǎng)菌)與包括AOB(自養(yǎng)菌)在內(nèi)的活性污泥微生物發(fā)生接合轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)。(3)攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌與AOB的接合轉(zhuǎn)移,是造成SBR硝化效率下降,污泥形狀改變(增加出水SS)的主要原因。單純的供體菌和RP4質(zhì)粒并不能產(chǎn)生較大影響。(4)構(gòu)建的SBR中AOB的優(yōu)勢(shì)菌群是Nitrosomonas和βproteobacterium。在發(fā)生RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移之后,菌群結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯改變。說明RP4質(zhì)粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群結(jié)構(gòu)改變?cè)斐傻摹?5)RP4質(zhì)粒在AOB中發(fā)生的接合轉(zhuǎn)移可以上調(diào)amoA基因和hao基因的轉(zhuǎn)錄。這有可能是RP4質(zhì)粒導(dǎo)致的AMO等相關(guān)酶數(shù)量或(和)功能不足的一種反饋調(diào)節(jié)。
[Abstract]:In this paper , we studied the effect mechanism of RP4 plasmid and AOB on the environment and human health , and the effect mechanism of RP4 plasmid on AOB was studied . The results showed that the rate of ammonia nitrogen removal decreased to about 1 . 7 mg / L at the end of the experiment . The results showed that the rate of ammonia nitrogen removal decreased to about 1 . 7 mg / L at the end of the experiment . The results showed that the nitrogen removal efficiency of the reactor was reduced to about 1 . 7 mg / L . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria was about 10 - 4 . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria increased after the donor bacterium was added . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria increased after the addition of donor bacteria . ( 4 ) The dominant flora of AOB in SBR was Nitrosomonas and 尾 proteinate . After the transfer of RP4 plasmid , the structure of bacteria did not change significantly . The decrease of ammonia oxidation efficiency caused by RP4 plasmid was not caused by the change of the structure of the bacteria .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X172;X703

【參考文獻(xiàn)】

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1 楚江;王一農(nóng);章文軍;張德民;;亞硝化單胞菌(Nitrosomonas sp.)THD-1分離鑒定及高密度培養(yǎng)[J];生物學(xué)雜志;2012年05期

2 陳亞平;葉宏;王娟;;亞硝化單胞菌的分離鑒定及其降解特性的研究[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2007年09期

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1 張斌;MBR和GSBR中微生物群落生態(tài)學(xué)研究[D];天津大學(xué);2010年

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1 鄒文慈;耐藥質(zhì)粒RP4在不同微生物聚集體中水平轉(zhuǎn)移規(guī)律及其對(duì)氨氧化的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

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本文編號(hào)：1526103