精原細(xì)胞瘤起源于原始生殖細(xì)胞，是睪丸最常見的惡性腫瘤，約占30％ ～40％ ，好發(fā)年齡為35～45歲? 。早期精原細(xì)胞瘤手術(shù)簡單，術(shù)后輔助以放療和化療，90％ 能痊愈，晚期發(fā)現(xiàn)則療效差，死亡率高。因此早期發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞瘤對提高患者的生存率、治愈率起著極其關(guān)鍵的作用。目前許多學(xué)者開始關(guān)注基因表達(dá)學(xué)方法來早期診斷精原細(xì)胞瘤，并研究精原細(xì)胞瘤相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)功能、表達(dá)與突變以及多基因之間的相互聯(lián)系，對于揭示精原細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探索臨床早期診斷的分子標(biāo)記和治療靶點(diǎn)以及預(yù)后評價(jià)等都具有十分重要的意義。本文運(yùn)用免疫組化S-P法和PCR．單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)法，以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、p53基因來探索精原細(xì)胞瘤診斷和治療的新思路、新方法。

　　1 材料與方法

　　1．1 病例和標(biāo)本38例精原細(xì)胞瘤病例選自1991至2007年外科手術(shù)根治標(biāo)本，主要來自江蘇省人民醫(yī)院、延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院、江蘇省蘇北人民醫(yī)院和揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院存檔睪丸精原細(xì)胞瘤蠟塊。按照WHO(2004)睪丸腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)揚(yáng)州市病理診斷中心再次病理核實(shí)為精原細(xì)胞瘤。根據(jù)睪丸腫瘤臨床分期標(biāo)準(zhǔn) 將精原細(xì)胞瘤統(tǒng)一進(jìn)行臨床分期，I期：腫瘤局限于睪丸，沒有腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況；1I期：腫瘤轉(zhuǎn)移至腹膜后淋巴結(jié)；111期：有膈上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或淋巴結(jié)外轉(zhuǎn)移(肺，肝，腦，骨)。其中I期15例；II期11例，Ⅲ期12例。對照用正常睪丸組織10例，來自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室尸檢標(biāo)本。

　　1．2 試劑和方法二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。采用免疫組化(S-P)法染色，所用一抗VEGF、p53及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin—peroxidase，SP)試劑盒均購自購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。按S-P試劑盒說明書操作。每批染色均設(shè)陰性空白對照(以PBS液代替一抗)。

　　p53引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。首先提取精原細(xì)胞瘤DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再配制2％的瓊脂糖凝膠，對p53基因5、6、7、8外顯子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采用PCR．SSCP分析對組織標(biāo)本進(jìn)行p53基因突變的檢測和判斷。

　　1．3 結(jié)果判定高倍鏡下隨機(jī)觀察記數(shù)10個高倍視野(×200)中陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和顯色強(qiáng)度分為：(一)，陽性細(xì)胞數(shù)小于5％或無陽性物質(zhì)的表達(dá)；(+)，陽性細(xì)胞數(shù)5％ ～25％或顯色淺；(++)，陽性細(xì)胞數(shù)25％ ～50％或顯色深；(+++)，陽性細(xì)胞數(shù)大于50％及顯色深。

　　1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10．0及EXCEL 2003軟件進(jìn)行分析，組間比較選用x 檢驗(yàn)，VEGF和p53表達(dá)的相關(guān)性分析選用Spearman等級相關(guān)比較，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2．1 VEGF在精原細(xì)胞瘤中的表。

　　2．2 p53陽性在精原細(xì)胞瘤中細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)。

　　2．3 VEGF和p53的相關(guān)檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)(r)=0．183(P>0．05)，VEGF和p53表達(dá)之間無相關(guān)。

　　2．4 p53在精原細(xì)胞瘤中突變的檢測結(jié)果選取11例精原細(xì)胞瘤標(biāo)本，p53基因突變的有5例，突變率為45．45％ ，其中第5外顯子突變的有3例、第7外顯子突變的有1例、第8外顯子突變的有1例。

　　3 討論

　　3．1 精原細(xì)胞瘤中VEGF的表達(dá) 1989年Ferrara等 在體外培養(yǎng)的牛垂體細(xì)胞中分離出一種糖蛋白，它在體內(nèi)外都表現(xiàn)出特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長并誘導(dǎo)血管生成的作用，因此稱之為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。VEGF在許多腫瘤中都有過表達(dá)的現(xiàn)象，國內(nèi)外許多報(bào)道表明，VEGF與精原細(xì)胞瘤之間關(guān)系密不可分。Restucci等 經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出在精原細(xì)胞瘤中，VEGF的表達(dá)以及微血管的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織，在轉(zhuǎn)移的精原細(xì)胞瘤中VEGF的表達(dá)和微血管的密度也高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的精原細(xì)胞瘤。

　　本實(shí)驗(yàn)通過對精原細(xì)胞瘤臨床分期，檢測VEGF在精原細(xì)胞瘤各期中的表達(dá)情況顯示：I期與Ⅱ期、I期與Ⅲ期兩組間比較有顯著差異(P<0．05)，Ⅱ期與Ⅲ期之間比較無顯著差異(P>0．05)；精原細(xì)胞瘤與正常對照組織之間比較有顯著差異(P<0．01)。由此可見，VEGF隨著精原細(xì)胞瘤臨床分期的進(jìn)展，陽性表達(dá)率也越來越高，雖然Ⅱ期與Ⅲ期之間比較無明顯差異，但仍然可以看到表達(dá)量的遞增趨勢。而正常睪丸組織中VEGF陽性的例數(shù)少，且表達(dá)量顯著低于腫瘤組織。此外本文亦發(fā)現(xiàn)VEGF在精原細(xì)胞瘤的腫瘤血管中大部分都表現(xiàn)出明顯陽性，提示VEGF在精原細(xì)胞瘤的發(fā)生和臨床進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。由此推測，精原細(xì)胞瘤中腫瘤細(xì)胞的快速增殖在局部形成一個相對缺氧的微環(huán)境，缺氧反過來促進(jìn)VEGF的分泌，進(jìn)而促使腫瘤血管生成、微血管通透性增加，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步增殖提供營養(yǎng)基礎(chǔ)，筆耕論文新浪博客，從而形成一個惡性循環(huán)。由此不難得出：VEGF不僅反映了精原細(xì)胞瘤中血管的生成能力，而且與其惡性進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，提示VEGF是一個良好的反映睪丸精原細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的指標(biāo)之一，如果能在精原細(xì)胞瘤發(fā)生的早期敲除VEGF基因，似乎可以明顯延緩甚至停止精原細(xì)胞瘤的發(fā)展，當(dāng)然這種方法還需繼續(xù)研究。

　　3．2 精原細(xì)胞瘤中p53的表達(dá)和變異p53基因是研究最為廣泛深入的腫瘤相關(guān)基因，在50％ ～60％ 的人類各系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。p53被稱為“基因組衛(wèi)士”，其主要生物學(xué)功能是維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

　　p53基因極其容易突變，Lewis等報(bào)道p53陽性表達(dá)在精原細(xì)胞瘤中為90％ ，在正常的睪丸組織中不表達(dá)，且在精原細(xì)胞瘤中p53隨著腫瘤的臨床分期增加而下降。Eid等¨ 報(bào)道p53基因在精原細(xì)胞瘤和胚胎性癌中陽性表達(dá)最強(qiáng)，p53表達(dá)在腫瘤臨床早期最高，到后期反而降低。

　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p53在精原細(xì)胞瘤臨床分期I期中的表達(dá)率達(dá)到93．33％ ，1I期與Ⅲ期的表達(dá)率分別為54．55％和50％ 。與前人結(jié)果比較一致，證明p53在精原細(xì)胞瘤發(fā)生的早期起著非常重要的作用。由此推斷：精原細(xì)胞瘤在剛剛發(fā)生時(shí)，p53起著很重要的作用，隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展，p53的作用逐漸減弱，最后在精原細(xì)胞瘤的晚期僅起很微弱的作用，甚至起不到促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。因此可提示，監(jiān)測p53基因可以反映精原細(xì)胞瘤臨床早期的生物學(xué)行為，可用以早期發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞瘤，若早期敲除突變的p53基因或避免p53基因發(fā)生突變，似可為延緩精原細(xì)胞瘤的發(fā)展起到一定作用。

　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p53的5號外顯子有3例突變，7號有1例突變，8號有1例突變，p53基因突變率為45．45％ ；5例突變中有4例是處于臨床分期I期，1例處于Ⅱ期，說明從某種程度上可以認(rèn)為p53在精原細(xì)胞瘤的早期容易發(fā)生突變，在精原細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，p53在早期起較大作用。

　　3．3 精原細(xì)胞瘤中VEGF的表達(dá)與p53的關(guān)系關(guān)于精原細(xì)胞瘤中VEGF與p53相關(guān)性的研究較少，本實(shí)驗(yàn)將VEGF與p53進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩者并無相關(guān)性，反而發(fā)現(xiàn)VEGF在精原細(xì)胞瘤的發(fā)展中呈遞增趨勢，而p53僅僅在精原細(xì)胞瘤的發(fā)生早期起作用。由此說明，與兩者相關(guān)的基因在精原細(xì)胞瘤中沒有明顯的協(xié)同作用，在精原細(xì)胞瘤中并不存在一條p53直接調(diào)節(jié)VEGF的通路，VEGF可能不受p53的直接調(diào)節(jié)。