Gtl2基因位于小鼠12號染色體末端的Dlk1-Dio3印記區(qū)間,其轉(zhuǎn)錄的長非編碼RNA Gtl2對胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生都具有重要功能。本實驗室前期對小鼠早期胚胎的研究發(fā)現(xiàn),Gtl2于桑葚胚期開始表達,并最終特異性定位于囊胚內(nèi)細胞團(ICM)。功能研究表明,干擾Gtl2的表達雖然不影響囊胚發(fā)育率,但會影響囊胚的孵化(hatching)、體外生長(outgrowth)和內(nèi)細胞團(ICM)的形成。進一步研究發(fā)現(xiàn),Gtl2的表達下調(diào)導致囊胚ICM特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4的表達下降,提示Gtl2很可能通過影響Oct4而發(fā)揮作用。前期實驗已經(jīng)證實,Gtl2可能作為ceRNA(competing endogenous RNA)通過miRNA途徑調(diào)控Oct4的表達,從而在早期胚胎中發(fā)揮作用。因此,本課題旨在篩選可能與Gtl2結(jié)合并調(diào)控Oct4的候選miRNA,并揭示Gtl2在小鼠早期胚胎中調(diào)控Oct4可能的分子機制。首先,利用生物信息學網(wǎng)站工具并結(jié)合已發(fā)表的論文,我們篩選出既能與Gtl2有潛在結(jié)合能力又被實驗證實可以下調(diào)Oct4的候選miRNAs:let-7c(2個結(jié)合位點)、miR-24、miR-29a...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 長非編碼RNA
        1.1.1 長非編碼RNA分類
        1.1.2 LncRNA的作用
        1.1.3 LncRNA與早期胚胎
    1.2 長非編碼RNA Gtl2 的研究進展
        1.2.1 Dlk1-Dio3 印記區(qū)間
        1.2.2 Gtl2(Meg3)在腫瘤中的相關(guān)研究
        1.2.3 Gtl2 在著床后胚胎中的相關(guān)研究
    1.3 研究意義和主要研究內(nèi)容
        1.3.1 本課題的研究意義
        1.3.2 本課題的主要研究內(nèi)容
        1.3.3 技術(shù)路線
第2章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物、菌株、細胞系及載體
        2.1.2 實驗試劑、試劑盒
        2.1.3 實驗儀器、常用網(wǎng)站、軟件、引物、測序
    2.2 實驗方法
        2.2.1 重組載體的構(gòu)建
        2.2.2 突變載體的構(gòu)建
        2.2.3 細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        2.2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗
        2.2.5 細胞總RNA的提取
        2.2.6 RNA的反轉(zhuǎn)錄和定量PCR
        2.2.7 體外轉(zhuǎn)錄
        2.2.8 用于顯微注射的受精卵的獲取
        2.2.9 顯微注射和胚胎的體外培養(yǎng)
        2.2.11 胚胎的體外生長(outgrowth)實驗
第3章 篩選結(jié)合Gtl2 并靶向調(diào)控Oct4的miRNA
    3.1 引言
    3.2 生物信息學預測與Gtl2 結(jié)合并靶向調(diào)控Oct4的miRNA
    3.3 構(gòu)建雙熒光素酶報告系統(tǒng)的pMIR-report重組載體
    3.4 構(gòu)建雙熒光素酶報告系統(tǒng)的pMIR-report突變載體
    3.5 構(gòu)建雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定miRNA與 Gtl2 發(fā)生相互作用
    3.6 討論
    3.7 本章小結(jié)
第四章 Gtl2 在細胞水平與候選miRNA相互作用研究
    4.1 引言
    4.2 MLTC-1 細胞中驗證miRNA與內(nèi)源性Gtl2 的相互作用
    4.3 N2a細胞中驗證let-7c與內(nèi)源性Gtl2 的相互作用
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第五章 Gtl2 在胚胎水平中通過候選miRNA途徑發(fā)揮作用研究
    5.1 引言
    5.2 Gtl2 轉(zhuǎn)錄本的擴增
    5.3 .胚胎中挽救實驗驗證miRNA與 Gtl2 發(fā)生相互作用
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
附錄一
附錄二
附錄三
附錄四
致謝



本文編號：4013166