試驗(yàn)旨在對(duì)轉(zhuǎn)座酶Tn3的酶活力提高和進(jìn)化進(jìn)行初步探索。采用PCR擴(kuò)增、限制性酶切、DNA連接、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、易錯(cuò)PCR的優(yōu)化及構(gòu)建、D值的測(cè)定、酶切鑒定方法對(duì)轉(zhuǎn)座酶Tn3進(jìn)行體外定向進(jìn)化研究。結(jié)果表明,用SacⅠ和XbaⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切,得到了450 bp的酶切產(chǎn)物;在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體24 h,測(cè)量其D值,經(jīng)過(guò)3輪重復(fù)性的研究,其D值和增殖能力從開(kāi)始的0上升至0.18、0.42、0.60,說(shuō)明Tn3活性有了明顯的提高;將篩選得到的進(jìn)化型重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒抽提,用內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)進(jìn)化型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物條帶相對(duì)較小;之后對(duì)進(jìn)化型重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)Tn3基因序列的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變以及Tn3-Gal4靶向序列中間的CCR5-delta32基因被切除。說(shuō)明成功完成了轉(zhuǎn)座酶Tn3基因的克隆;確立了易錯(cuò)PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系;選擇卡那霉素作為篩選標(biāo)記對(duì)進(jìn)化型Tn3進(jìn)行篩選,初步驗(yàn)證利用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基和對(duì)菌液D值的測(cè)定來(lái)進(jìn)行篩選是可行的;Tn3基因序列突變和基因敲除,說(shuō)明不論是在功能上還是在基因序列上Tn3都發(fā)生了改變,這種變化正是...

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【部分圖文】：

圖3不同MnCl2濃度下易錯(cuò)PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2不同MgCl2濃度下易錯(cuò)PCR擴(kuò)增結(jié)果2.3目的基因的篩選及鑒定

圖1重組質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳

將Tn3基因與克隆載體連接,用SacⅠ和XbaⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。酶切結(jié)果顯示,在450bp處出現(xiàn)了酶切產(chǎn)物,與之前進(jìn)行質(zhì)粒重組時(shí)所連接的片段大小一致。由此可以初步判定已成功地完成了Tn3基因的克隆。2.2易錯(cuò)PCR體系的優(yōu)化及構(gòu)建

圖2不同MgCl2濃度下易錯(cuò)PCR擴(kuò)增結(jié)果

考察Mn2+濃度,結(jié)果顯示不同濃度MnCl2在450bp處都出現(xiàn)目的條帶,相比之下只有MnCl2濃度為0.5mmol/L的條帶亮度較深,因此0.5mmol/L的MnCl2為Tn3易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系的最佳濃度(圖3)。經(jīng)過(guò)對(duì)不同MgCl2和MnCl2濃度的考察,得到易錯(cuò)PCR....

圖4三輪菌液不同時(shí)間D600nm值曲線圖

由圖5可知,與原始重組質(zhì)粒相比,進(jìn)化型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物條帶較小。因此可以初步判斷,進(jìn)化型Tn3-Gal4已將目的基因片段CCR5-delta32靶向切除。圖5篩選菌株酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

本文編號(hào)：3979361