為了簡化純化步驟,節(jié)約生產(chǎn)成本,筆者構(gòu)建了能夠胞外分泌鼠羧肽酶原B(proCPB)的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB,并進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。結(jié)果表明:在信號肽OmpA的引導(dǎo)下,proCPB成功分泌至胞外,激活后的羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)比酶活為131.22 U/mg。通過單因素及正交試驗(yàn)對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳培養(yǎng)基組合為甘油7 g/L、復(fù)合氮源15 g/L、MgSO₄ 4 mmol/L、山梨醇0.3 mol/L、NaCl 10 g/L;最佳發(fā)酵條件為誘導(dǎo)溫度30℃,誘導(dǎo)時(shí)間24 h。優(yōu)化后,胞外proCPB的相對表達(dá)量為6.35(優(yōu)化前的相對表達(dá)量為1)。首次實(shí)現(xiàn)了鼠羧肽酶原B在大腸桿菌中的胞外分泌表達(dá),為羧肽酶B的工業(yè)化直接應(yīng)用提供了一定的技術(shù)支持。

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【部分圖文】：

圖1重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-OmpA-proCPB雙酶切驗(yàn)證

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將構(gòu)建得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-OmpA-proCPB用EcoRⅠ和HindⅢ酶切驗(yàn)證,結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,大小為5724和1313bp的條帶,分別與pET28a線性化載體和OmpA-proCPB-6*His融合片段大小一致,且測序結(jié)....

圖2重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB

將重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,誘導(dǎo)表達(dá)30h后取發(fā)酵液進(jìn)行離心,所得上清液即為粗酶液。經(jīng)鎳柱分離純化,并使用SDS-PAGE進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,條帶2為單一條帶,大小約為4.6×104,條帶大小與重組蛋白理論分子....

圖3胰蛋白酶最佳酶解時(shí)間的確定

羧肽酶原B是羧肽酶B的酶原形式,胰蛋白酶通過在Arg95處切除前導(dǎo)肽可將羧肽酶原B激活,得到有活性的羧肽酶B。胰蛋白酶的酶解條件對羧肽酶B的酶活性至關(guān)重要。筆者在1∶50質(zhì)量比的條件下,對胰蛋白酶的酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)酶解時(shí)間過短,羧肽酶原B不能被完全酶解,只能得到部分羧肽酶....

圖4純化后CPB的SDS-PAGE

透析后的proCPB酶液經(jīng)胰蛋白酶酶解2h后,立即加入0.1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應(yīng),并進(jìn)行鎳柱分離純化,對洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,通過試驗(yàn)得到單一目的條帶,大小約為3.5×104,經(jīng)測定比酶活為131.22U/mg....

本文編號：4000927