發(fā)布時(shí)間：2024-05-20 03:01

　　[目的]旨在探究細(xì)胞周期因子Geminin對Cas9在細(xì)胞基因組中的編輯效率是否有影響。[方法]將Geminin的前40個(gè)氨基酸序列對應(yīng)的cDNA序列克隆到含靶向COSMC基因的sgRNA的pX459質(zhì)粒pX459-COSMC-Cas9(wtCas9)上得到能在Cas9蛋白N端融合表達(dá)Geminin片段的pX459-COSMC-Geminin-Cas9質(zhì)粒(Geminin-Cas9)。在人胚胎腎細(xì)胞HEK293T或人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)wtCas9和Geminin-Cas9蛋白質(zhì),檢測并比較細(xì)胞中Cas9的表達(dá)水平和Cas9編輯COSMC基因的效率。[結(jié)果]Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)相比wtCas9質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Geminin-Cas9質(zhì)粒的細(xì)胞中Cas9表達(dá)水平更低,Geminin-Cas9載體對COSMC基因的編輯效率在編輯前期也相對較低,但隨著編輯時(shí)間的延長,兩者的編輯效率趨于一致。[結(jié)論]細(xì)胞周期因子Geminin的存在能降低Cas9在細(xì)胞中的總體表達(dá)水平,在編輯前期會(huì)在一定程度上降低Cas9的編輯效率,而延長編輯時(shí)間又能消除這一影響。

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【部分圖文】：

圖1編輯細(xì)胞基因組中COSMC基因的過程示意圖

將HEK293T細(xì)胞種在12孔板中，在細(xì)胞融合度達(dá)到60～70%時(shí)同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等量的wtCas9和Geminin-Cas9質(zhì)粒(具體操作按Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書)，轉(zhuǎn)染24h后將培養(yǎng)基換成帶有2.5μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基，篩選48h后將細(xì)胞傳代除去死去的細(xì)胞。在....

圖2Geminin-Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建

在HEK293T細(xì)胞和HT29細(xì)胞中同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等量的wtCas9和Geminin-Cas9質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后加入終濃度5μg/mL或10μg/mL的cycloheximide(CHX)，在不同時(shí)間收集細(xì)胞樣品，通過WesternBlotting方法去檢測Cas9蛋白質(zhì)在....

圖3wtCas9和Geminin-Cas9在細(xì)胞中Cas9表達(dá)水平的比較

在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染同等量的wtCas9和Geminin-Cas9質(zhì)粒后，在不同時(shí)間收集細(xì)胞提取基因組DNA檢測并比較其編輯效率。收集細(xì)胞提取細(xì)胞基因組后，通過基因組PCR擴(kuò)增得到包含靶序列的一段COSMC基因片段(圖4A)，將PCR產(chǎn)物送測序。從測序結(jié)果圖可見，與sg....

圖4wtCas9和Geminin-Cas9在細(xì)胞中編輯效率的比較

將測序文件放入TIDE網(wǎng)站測得Cas9在不同時(shí)間點(diǎn)對COSMC基因的編輯效率，結(jié)果表明在HEK293T細(xì)胞中，在前面幾天Geminin-Cas9的編輯效率比wtCas9更低，但隨著時(shí)間的推移，兩者的編輯效率均逐漸升高，到傳代后4d左右編輯效率會(huì)基本持平(圖4D)。這可能是由于....

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