為了在酵母中高通量、高效率地對外源基因進(jìn)行克隆和表達(dá),本研究以酵母表達(dá)載體pYES2為基礎(chǔ),構(gòu)建高效克隆表達(dá)T載體。pYES2是釀酒酵母的一種高效表達(dá)載體,在其多克隆位點處設(shè)計插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同時將其載體中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位點進(jìn)行定點突變,構(gòu)建出pYES2-T釀酒酵母高效表達(dá)T載體。利用XcmⅠ酶切載體pYES2-T,使其產(chǎn)生兩個突出的T末端,一方面可以通過PCR產(chǎn)物加A的方式直接進(jìn)行TA克隆;另一方面可在半乳糖誘導(dǎo)啟動子的調(diào)控下,對TA克隆后的外源基因在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)。利用該系統(tǒng)高通量地對人工合成耐鹽系列基因NLEAs進(jìn)行篩選,研究結(jié)果表明,該系統(tǒng)可以在釀酒酵母中一步式完成片段克隆及耐鹽基因的篩選。本研究構(gòu)建的酵母表達(dá)T載體使用方便、效率高、成本低,應(yīng)用前景廣闊。

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【部分圖文】：

圖1片段XcmⅠ-Intron-XcmⅠ擴(kuò)增

使用XcmⅠ限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建好的酵母表達(dá)T載體pYES2-T進(jìn)行酶切，電泳膠回收獲得線性化的片段(圖6A)。通過設(shè)計特異性引物擴(kuò)增人工合成的耐鹽片段nlea1基因(未發(fā)表數(shù)據(jù))(圖6B)，凝膠純化并加A處理，連接線性化T載體。連接產(chǎn)物通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10，并通過....

圖2酶切載體pYES2

圖1片段XcmⅠ-Intron-XcmⅠ擴(kuò)增對該酵母表達(dá)載體進(jìn)行功能驗證，通過將連接液以及未經(jīng)XcmⅠ酶切的pYES2-T載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母后直接在含有半乳糖以及400mmol/L和600mmol/LNaCl濃度梯度的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3d后對pYES2-T-....

圖4pYES2-T載體

對該酵母表達(dá)載體進(jìn)行功能驗證，通過將連接液以及未經(jīng)XcmⅠ酶切的pYES2-T載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母后直接在含有半乳糖以及400mmol/L和600mmol/LNaCl濃度梯度的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3d后對pYES2-T-nlea1重組菌株進(jìn)行篩選及驗證觀察，結(jié)果表明....

圖3pYES2-T測序驗證

本研究以酵母表達(dá)載體pYES2為基礎(chǔ)，對其進(jìn)行改造，在其多克隆位點的SacⅠ和BamHⅠ酶切位點處插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ序列，構(gòu)建出酵母表達(dá)T載體。pYES2具有尿嘧啶缺陷型標(biāo)記，配合其抗性標(biāo)記基因氨芐霉素可有效篩選出陽性克隆。其半乳糖誘導(dǎo)型啟動子位于多克隆位點上....

本文編號：3976620