目的構(gòu)建帶有腸激酶序列的p ET32a-neuritin重組質(zhì)粒,為后期酶切去除重組蛋白His標(biāo)簽奠定基礎(chǔ),并篩選高表達(dá)菌株。方法利用基因工程技術(shù)在p ET32a載體自身His標(biāo)簽和腸激酶序列之后克隆插入neuritin基因。首先PCR擴(kuò)增目的基因neuritin,與原核表達(dá)載體p ET32a重組后,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),采用菌落PCR、雙酶切鑒定,并將鑒定陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)后,測序鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后,SDSPAGE和Western blot鑒定重組蛋白。對50個陽性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定其表達(dá)水平。結(jié)果菌落PCR、雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符,且測序結(jié)果比對正確。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE和Western blot結(jié)果證實(shí)是Neuritin蛋白。SDS-PAGE鑒定高表達(dá)菌株蛋白表達(dá)量,篩選出1株高表達(dá)菌株。結(jié)論本研究成功構(gòu)建帶有腸激酶序列的p ET32a-neuritin重組質(zhì)粒,并獲得高表達(dá)Neuritin蛋白菌株,為后期獲得無標(biāo)簽重組Neuritin蛋白奠定基礎(chǔ)。

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圖1pET32a-neuritin重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

在pET32a載體自身His標(biāo)簽和腸激酶序列之后克隆插入neuritin基因，限制性內(nèi)切酶分別為NcoI、XholI。2.2目的基因neuritin的PCR產(chǎn)物鑒定

圖2neuritinPCR產(chǎn)物鑒定

PCR擴(kuò)增neuritin產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在約300bp處出現(xiàn)特異性條帶。與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。2.3pET32a-neuritin重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定

圖3重組質(zhì)粒pET32a-neuritin菌落PCR鑒定

將neuritin的PCR產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后，對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示在300bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。2.4pET32a-neuritin重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

圖4重組質(zhì)粒pET32a-neuritin雙酶切鑒定

將菌落PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并用NcoI、XholI酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見約300bp片段和5000bp片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。結(jié)果表明neuritin基因已成功插入到pET32a載體中。2.5重組質(zhì)粒pET32a-neuritin測序鑒....

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