【目的】探索牛和果蠅DHX36解旋酶的表達(dá)純化條件及底物結(jié)合活性,為深入研究DEAH-box解旋酶提供理論參考�！痉椒ā恳暂^高等動(dòng)物牛(Bos taurus)和較低等動(dòng)物黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36為研究對象,首先,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,將2種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中,誘導(dǎo)表達(dá)2種目的蛋白,利用Ni-NTA層析柱、HisTrap SP HP柱純化得到目的蛋白。然后,采用熒光各向異性法(FA)研究溶液和溫度條件對2種蛋白底物結(jié)合活性的影響,以及二者的底物結(jié)合偏好性。最后利用快速停流-熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)對2種DHX36的雙鏈底物解旋活性進(jìn)行比較�！窘Y(jié)果】獲得了純度大于95%的全長BtDHX36和DmDHX36蛋白,2種DHX36解旋酶的最佳底物結(jié)合條件為:20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl₂、反應(yīng)溫度37℃。在此條件下...

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圖1pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36表達(dá)載體構(gòu)建（A）、雙酶切檢測（B）及蛋白表達(dá)純化結(jié)果(C、D、E)

BtDHX36和DmDHX36表達(dá)載體構(gòu)建過程見圖1-A。用EcoRⅠ、XhoⅠ對重組載體進(jìn)行雙酶切鑒定,切出大小約為2.8kb的BtDHX36和DmDHX36基因片段(圖1-B)。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)18℃下誘導(dǎo)14h,目的蛋白BtD....

圖2BtDHX36和DmDHX36解旋酶結(jié)合活性的條件優(yōu)化

測定DHX36與底物的結(jié)合活性,將得到的各向異性值歸一化并用米氏方程擬合,可得DHX36在不同條件下的米氏常數(shù)Km,結(jié)果見圖2。由圖2可知,氯化鈉濃度、氯化鎂濃度、pH以及溫度均對DHX36的結(jié)合活性有一定影響,且對2種DHX36解旋酶的影響趨勢一致。當(dāng)氯化鈉濃度為50mmol....

圖3BtDHX36和DmDHX36解旋酶的底物結(jié)合偏好性比較

用16,24,32,42ntssDNA測定底物長度對BtDHX36和DmDHX36結(jié)合活性的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,2種同源蛋白都能較好地結(jié)合4種ssDNA;對BtDHX36而言,16,24,32,42ntss-DNA的Km依次為(31.0±2.1),(30.3....

圖4ssDNA底物長度對2種DHX36解旋酶結(jié)合活性的影響

圖3BtDHX36和DmDHX36解旋酶的底物結(jié)合偏好性比較2.52種DHX36解旋酶解旋偏好性比較

本文編號：3973091