目的利用Cre-loxP重組酶系統(tǒng)研究mRNA在細(xì)胞間傳遞過程及意義。方法構(gòu)建和篩選穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶的供體細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)loxP-DsRed-loxP-eGFP的受體細(xì)胞。將供、受體細(xì)胞共培養(yǎng)或在Transwell^TM中共培養(yǎng),設(shè)置單獨(dú)受體細(xì)胞組為對照,72 h后觀察統(tǒng)計各組受體細(xì)胞eGFP陽性率,利用細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞染色檢測eGFP陽性細(xì)胞中Cre表達(dá)情況,并探討供體細(xì)胞死亡、細(xì)胞膜納米管、 Rho相關(guān)激酶(ROCK)信號通路對Cre mRNA傳遞的影響。結(jié)果將供、受體細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)組eGFP為陽性,單獨(dú)受體細(xì)胞組、 Transwell^TM共培養(yǎng)組eGFP均為陰性,表明細(xì)胞接觸可以介導(dǎo)Cre mRNA傳遞,免疫熒光染色結(jié)果顯示Cre蛋白可在受體細(xì)胞中翻譯和入核。此外,Cre mRNA的傳遞主要通過活細(xì)胞,而膜納米管及ROCK信號通路抑制劑可部分阻滯該過程。結(jié)論 mRNA可以通過細(xì)胞間接觸在活細(xì)胞中傳遞,進(jìn)入受體細(xì)胞后還可翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能。

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo-Cre的構(gòu)建
        1.2.2 慢病毒包裝和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建
        1.2.3 單克隆細(xì)胞株的制備
        1.2.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞中Cre蛋白的表達(dá)和分布
        1.2.5 供、 受體細(xì)胞共培養(yǎng)及受體細(xì)胞中eGFP表達(dá)統(tǒng)計
        1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 單克隆細(xì)胞株的篩選和驗證
    2.2 受體細(xì)胞可以被Cre蛋白重組并表達(dá)eGFP
    2.3 細(xì)胞間直接接觸介導(dǎo)Cre傳遞
    2.4 Cre mRNA在受體細(xì)胞中的翻譯可介導(dǎo)受體細(xì)胞基因組重組
    2.5 Cre mRNA的傳遞不依賴mNT和死亡細(xì)胞
3 討論



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