為了利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物學(xué)活性的重組牛胃溶菌酶(rcsLYZ)蛋白,試驗(yàn)構(gòu)建了能分泌表達(dá)rcsLYZ的重組酵母菌株,并通過因子篩選試驗(yàn)(Plackett-Burman)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面方法研究了接種量等參數(shù)對(duì)rcsLYZ活性的影響,并且利用管碟法檢測了rcsLYZ的抑菌效果。結(jié)果表明:培養(yǎng)體積、誘導(dǎo)時(shí)間和甲醇濃度對(duì)rcsLYZ表達(dá)水平有顯著影響(P<0.01);響應(yīng)面法優(yōu)化后rcsLYZ活性為415.2 U/mL(培養(yǎng)體積為42 mL,誘導(dǎo)時(shí)間為89 h,甲醇濃度為1.1%),與理論預(yù)測最大值(431 U/mL)接近;rcsLYZ活性相較于優(yōu)化前有較大提高;rcsLYZ對(duì)溶壁微球菌、藤黃微球菌及金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用,對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌無抑制作用,說明rcsLYZ可以在畢赤酵母中表達(dá),優(yōu)化后活性較好,對(duì)部分細(xì)菌有抑菌效果。

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【部分圖文】：

圖1重組表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

重組pPICZαA-csLYZ質(zhì)粒用XhoⅠ和XbaⅠ酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在500bp附近發(fā)現(xiàn)酶切產(chǎn)物(420bp),大小與理論相符(見圖1泳道4)。重組pPICZαA-csLYZ質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ酶切后電轉(zhuǎn)化至X33酵母細(xì)胞中。在含600μg/mLZeocin的YPD....

圖2重組酵母菌株的PCR鑒定及其表達(dá)

選取3.1中表達(dá)量較高的4#菌株作為菌種用于后續(xù)發(fā)酵參數(shù)的篩選。通過Designexpert8軟件設(shè)計(jì)了7因素2水平的Plackett-Burman試驗(yàn)(見表2)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值作為最終結(jié)果。表2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果U·mL-1處理....

圖4牛胃溶菌酶抑菌試驗(yàn)結(jié)果

總之,本研究成功構(gòu)建了分泌表達(dá)rcsLYZ的重組酵母菌株,并通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)估接種量等參數(shù)對(duì)rcsLYZ表達(dá)的影響,結(jié)果接種量、培養(yǎng)體積、誘導(dǎo)時(shí)間及甲醇濃度等因素顯著影響rcsLYZ的表達(dá),選取培養(yǎng)體積等3個(gè)因素進(jìn)行了Box-Behnken試驗(yàn)及響應(yīng)面....

圖3各因素對(duì)牛胃溶菌酶活性交互影響效應(yīng)的響應(yīng)面分析圖與等高線圖

表5二次回歸模型的方差分析方差來源平方和(SS)自由度(df)均方和(MS)F值P值(Prob>F)模型1.20×105913330.7535.70<0.0001A15664.50115664.5041.950.000....

本文編號(hào)：3965023