[目的]表達(dá)和純化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制備多克隆抗體。[方法]RT-PCR擴(kuò)增NP基因,并克隆至原核表達(dá)載體pET-28a和真核表達(dá)載體pcDNA3.1中。將重組質(zhì)粒pET-28a-NP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析重組蛋白NP(rNP)的表達(dá)并親和層析純化rNP,以抗DHOV陽(yáng)性羊血清檢測(cè)其抗原性,免疫新西蘭兔制備抗血清,以ELISA法檢測(cè)其效價(jià)。將pcDNA3.1-NP轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞,以間接免疫熒光法評(píng)估抗體的結(jié)合活性,Western Blotting檢測(cè)抗體與重組蛋白的特異性反應(yīng)能力。[結(jié)果]pET-28a-NP和pcDNA3.1-NP重組質(zhì)粒構(gòu)建正確,原核表達(dá)的rNP約為55.3 kDa,并能被陽(yáng)性羊血清識(shí)別,制備的抗體效價(jià)為1:409 600,能特異性識(shí)別真核及原核表達(dá)產(chǎn)物。[結(jié)論]成功表達(dá)和純化rNP,并制備了多克隆抗體,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物學(xué)特性及其檢測(cè)試劑。

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【部分圖文】：

圖1NP基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒酶切鑒定

經(jīng)擴(kuò)增獲得了與預(yù)期條帶大小相符的1380bp的特異性DNA片段，而以雙蒸水為模板的陰性對(duì)照組未見(jiàn)條帶;重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NP、pET-28aNP分別用2組內(nèi)切酶酶切，凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)一條長(zhǎng)約1380bp左右的特異性目的基因條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明....

圖2重組蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析

用間接ELISA法對(duì)rNP免疫新西蘭兔后產(chǎn)生的兔多抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，其血清效價(jià)為1:409600(圖4)。結(jié)果表明經(jīng)蛋白免疫后，在新西蘭兔體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的抗rNP的血清。圖3陽(yáng)性羊血清驗(yàn)證重組蛋白抗原性WesternBlotting分析

圖3陽(yáng)性羊血清驗(yàn)證重組蛋白抗原性WesternBlotting分析

圖2重組蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析2.5兔多克隆抗體結(jié)合活性的IFA驗(yàn)證

圖4ELISA法檢測(cè)兔多抗血清效價(jià)

用兔抗NP多克隆抗體分別對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NP和pcDNA3.1質(zhì)粒的Vero細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NP重組質(zhì)粒的Vero細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光(圖5A)，而空白組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1)的細(xì)胞未見(jiàn)熒光出現(xiàn)(圖5B)。結(jié)果表明兔抗NP多克隆抗體可....

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