脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一類(lèi)含有非血紅素鐵的雙加氧酶,在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重組表達(dá)來(lái)源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較分析。通過(guò)對(duì)酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn):PaLOX、BtLOX的最適反應(yīng)溫度分別為25和35℃;最適反應(yīng)pH分別為7.0和7.5。PaLOX的K_cat/K_m較BtLOX高16.7倍,展現(xiàn)出更好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。為優(yōu)化PaLOX的可溶性表達(dá),采取了2種優(yōu)化策略:首先利用乳糖作為誘導(dǎo)劑代替異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),使胞內(nèi)酶活力提高了1.53倍,可溶表達(dá)水平提高了2.41倍;進(jìn)一步與觸發(fā)因子(triggering factor,TF)融合表達(dá),TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍,可溶表達(dá)水平提高3.19倍。該研究通過(guò)分析細(xì)菌來(lái)源脂肪氧合酶酶學(xué)性質(zhì)...

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圖1LOX的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

為研究LOX的表達(dá)情況，分別在E.coliBL21(DE3)中構(gòu)建表達(dá)PaLOX、BtLOX的重組質(zhì)粒pET-22b(+)/Palox、pET-22b(+)/Btlox(圖2-a)，并在20℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)。圖2構(gòu)建的LOX表達(dá)質(zhì)粒和Palox、Btlox表達(dá)蛋白....

圖2構(gòu)建的LOX表達(dá)質(zhì)粒和Palox、Btlox表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳分析圖

圖1LOX的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PaLOX、BtLOX在胞內(nèi)可溶和不溶部分均有明顯條帶，其大小約為70kDa。而B(niǎo)tLOX胞外未見(jiàn)重組蛋白條帶(圖2-b)。LOX活性結(jié)果顯示，PaLOX發(fā)酵上清液LOX酶活力為351U/DCW(UnitsperDr....

圖3溫度對(duì)LOX催化活性及穩(wěn)定性的影響

為評(píng)估LOX的應(yīng)用潛力，對(duì)LOX的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，重組PaLOX和BtLOX的最適反應(yīng)溫度分別為25和35℃(圖3-a)。隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，2種來(lái)源的LOX活力均顯著降低，但BtLOX活性下降較PaLOX明顯。....

圖4pH對(duì)LOX酶活力及穩(wěn)定性的影響

對(duì)酶有激活作用的激活劑，能在酶與底物之間形成一種酶-金屬離子-底物的三元復(fù)合物，有利于底物與酶的活性中心結(jié)合;而對(duì)酶活力有抑制作用的，則可作為酶的抑制劑。因此，實(shí)驗(yàn)研究了金屬離子對(duì)2種LOX酶活力的影響(圖5)。其中Mg2+和Na+對(duì)PaLOX和BtLOX有激活作用，Cu2+....

本文編號(hào)：3923734