藥用植物內(nèi)生菌所處生境獨特,經(jīng)過與植物的長期共同進化而具有合成新穎天然產(chǎn)物活性結(jié)構(gòu)的巨大潛力。本實驗室前期從19種藥用植物中分離得到94株拮抗內(nèi)生菌,論文通過多步驟活性檢測方法,結(jié)合生物信息學(xué)分析對其抑菌機制進行初步預(yù)測,并利用基因工程和qPCR技術(shù)進行驗證,來探索目標(biāo)菌株的抑菌活性特征。論文主要包括如下四部分內(nèi)容:1.多步驟活性檢測方法確定目標(biāo)菌株SAT1。將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)作為指示菌,以94株拮抗內(nèi)生菌為研究對象,初步篩選得到8株抑菌效果較強(抑菌帶寬>1.0 cm)的菌株。通過抑菌譜實驗、發(fā)酵液抑菌活性實驗以及離體枝條實驗等多步驟分析,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生鏈霉菌SAT1對栗疫菌、白假絲酵母等八種指示菌均具有抑制效果,并且對歐美楊潰瘍病和板栗疫病表現(xiàn)出一定的生防效果,優(yōu)于其它菌株,因此,將其作為本論文的研究對象。2.SAT1次級代謝基因簇抑菌活性物質(zhì)預(yù)測。通過antiSMASH分析Streptomyces sp.SAT1全基因組序列,一共預(yù)測到29種次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇。其中Cluster24和Cluster25與具有抑菌活性的潮霉素B和默諾霉素的生物合成基因簇...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 鏈霉菌的開發(fā)應(yīng)用
        1.1.1 鏈霉菌屬(Streptomyces)及其應(yīng)用
        1.1.2 鏈霉菌天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略
        1.1.3 鏈霉菌基因工程操作技術(shù)
    1.2 鏈霉菌調(diào)控基因
        1.2.1 調(diào)控基因的分類
        1.2.2 常見的調(diào)控基因
        1.2.3 多效性負調(diào)控基因wbIA
    1.3 熒光定量PCR技術(shù)
        1.3.1 熒光定量PCR內(nèi)參基因
        1.3.2 內(nèi)參基因選擇工具及其應(yīng)用
        1.3.3 常用的鏈霉菌內(nèi)參基因
    1.4 本課題研究意義、主要內(nèi)容及技術(shù)路線
        1.4.1 研究意義
        1.4.2 研究內(nèi)容
        1.4.3 技術(shù)路線
2 高抑菌活性生防菌株的篩選與鑒定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 供試菌株和指示菌
        2.1.2 試驗苗木
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 主要試劑和儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 拮抗內(nèi)生菌初篩及抑菌譜的檢測
        2.2.2 發(fā)酵液抑菌活性的檢測
        2.2.3 拮抗菌株鑒定
        2.2.4 生防實驗
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 拮抗菌株篩選及抑菌譜檢測
        2.3.2 菌株鑒定
        2.3.3 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對MRSA抑菌活性的影響
        2.3.4 離體枝條實驗
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 SAT1次級代謝基因簇分析及活性物質(zhì)的檢測
    3.1 實驗材料
        3.1.1 培養(yǎng)基
        3.1.2 實驗試劑和儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 活性物質(zhì)的萃取
        3.2.2 TLC法檢測目標(biāo)抗生素
        3.2.3 HPLC法檢測目標(biāo)抗生素
        3.2.4 生物信息學(xué)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 Streptomyces sp. SAT1次級代謝產(chǎn)物預(yù)測
        3.3.2 SAT1發(fā)酵液中活性物質(zhì)的萃取
        3.3.3 TLC和HPLC法檢測目標(biāo)抗生素
        3.3.4 Cluster 24和25的同源性比較分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 wblA表達載體的構(gòu)建及其對SAT1形態(tài)及抑菌活性的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 供試菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 引物合成及測序
        4.1.3 試劑、試劑盒和主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 質(zhì)粒DNA和鏈霉菌基因組DNA的提取
        4.2.2 PCR反應(yīng)條件
        4.2.3 DNA片段的純化、酶切和連接反應(yīng)
        4.2.4 甘油法制備感受態(tài)細胞和電轉(zhuǎn)化
        4.2.5 大腸桿菌和鏈霉菌的屬間接合轉(zhuǎn)移
        4.2.6 突變株的驗證及其表型特征和抑菌活性的變化
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 wblA表達載體的構(gòu)建和突變株的獲得
        4.3.2 突變株遺傳穩(wěn)定性和表型特征
        4.3.3 突變株抑菌能力的變化
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 熒光定量PCR檢測wblA對目標(biāo)基因簇表達量的影響
    5.1 實驗材料
        5.1.1 菌株
        5.1.2 試劑盒
        5.1.3 引物
        5.1.4 實驗儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 樣品準(zhǔn)備
        5.2.2 總RNA提取和qPCR
        5.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 候選內(nèi)參基因引物的擴增效率及特異性
        5.3.2 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估
        5.3.3 目的基因表達量分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 結(jié)論與展望
    6.1 創(chuàng)新點
    6.2 結(jié)淪
    6.3 展望
參考文獻
個人簡介
導(dǎo)師簡介
致謝



本文編號：3906490