肝素酶來源于肝素黃桿菌,是一類能夠特異性降解肝素和乙酰肝素的多糖裂解酶。目前研究發(fā)現,肝素酶在制備低分子量肝素、抑制腫瘤細胞增殖,清除血液中殘留肝素等方面具有重要的生物學作用,受到越來越多人的關注。目前研究最多的是肝素酶Ⅰ,肝素酶Ⅰ在重組大腸桿菌中可溶性表達低,導致其產量較低,純化較難,成本較高等問題,限制了其在醫(yī)藥方面的應用。因此尋找合適的方法來提高肝素酶Ⅰ的產量和純度具有重要的意義。分子伴侶素CpkA是從嗜熱菌Thermococcus kodakarensis中發(fā)現的耐熱伴侶蛋白,具有輔助蛋白折疊功能和ATPase活性。本文構建重組質粒pACYC-CpkA和切去前導肽并加上帶正電signal-tag的HepI’-28a質粒,并以單轉或共轉化形式轉入大腸桿菌E.coli DE3(BL21)中誘導表達,通過鎳柱純化,除鹽柱除鹽,陽離子交換柱層析等優(yōu)化純化方式獲得可溶性的HepI’蛋白;同時在E.coli DE3-RIPL中原核表達分子伴侶素CpkA,經85℃熱處理1h、飽和度為80%的硫酸銨沉淀、透析除鹽和陰離子交換柱層析,獲得高純度CpkA蛋白;利用本文制備的分子伴侶素CpkA蛋白在...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1肝素基本結構圖

第一章緒論1第一章緒論1.1肝素19世紀初，人們發(fā)現在動物組織中含有能夠抑制血液凝結的物質，1922年Howell最早將其從動物肝臟中提取分離出來，并正式將其命名為肝素（unfractionatedheparin，UFH）[1]。隨著科學技術的進步與發(fā)展，肝素的結構逐漸被大家所了....

圖1.2GroEL/ES的結構[46]

第一章緒論6端和赤道區(qū)，起傳遞信號的功能。GroES[48]因為對分子伴侶GroEL的復性功能有輔助作用，又被稱為協(xié)同分子伴侶。已經有實驗表明分子伴侶GroEL/ES在可以幫助底物蛋白在大腸桿菌中正確折疊[49,50]，在翻譯中和翻譯后起作用[51]。GroEL/ES通過靜電作用....

圖2.1HepI基因序列

第二章肝素酶I的原核表達8第二章肝素酶I的原核表達通過NCBI網站的GeneBank數據庫和查詢文獻[33]，最終確定肝素酶I（HepI）的堿基序列，全長1155bp。利用NEBcutterV2.0對HepI的序列進行分析，并與pET-28a中多克隆位點區(qū)域進行比對，確定在基因5....

圖2.2HepI-28a質粒的提取與PCR驗證結果圖

第二章肝素酶I的原核表達17圖2.2HepI-28a質粒的提取與PCR驗證結果圖1:HepI-28a質粒;2和3:以HepI-28a為模板進行PCR擴增出的產物;M:DNAMarkerDL150002.3.2測序驗證將初步篩選出來的質粒送到庫美公司測序，利用NCBIBlast將測....

本文編號：4002436