桿狀病毒是一類雙鏈、環(huán)狀、超螺旋的DNA病毒,擁有80 kb到180 kb的基因組,編碼大約100-180種蛋白。桿狀病毒被人類廣泛研究,以苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)最為突出,具有安全殺蟲劑的稱號,但因其殺蟲時(shí)間慢等局限性而不被大范圍使用。因此,加強(qiáng)桿狀病毒活性以及全面了解其基因組中重要基因的功能尤為關(guān)鍵,特別是結(jié)構(gòu)基因,ac132是其中之一。AcMNPV中的ac132位于基因組中的第132個開放閱讀框,ac132基因全長660bp,編碼關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)蛋白。有研究表明ac132的敲除對病毒DNA的復(fù)制和晚期基因沒有明顯的影響,但對病毒的形態(tài)發(fā)生有影響,ac132敲除以后,病毒發(fā)生基質(zhì)(VS區(qū))中出現(xiàn)包含單個核衣殼的卷毛狀結(jié)構(gòu),基本不出現(xiàn)正常的棒狀核衣殼,病毒發(fā)生基質(zhì)出現(xiàn)的時(shí)間延遲。但是Ac132蛋白對子代病毒增殖的影響尚不明確,因此我們針對Ac132蛋白在AcMNPV侵染宿主細(xì)胞過程中的功能展開研究。本研究主要分為三部分內(nèi)容:第一部分:重組桿狀病毒AcMNP...

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 桿狀病毒概述
        1.1.1 桿狀病毒簡介
        1.1.2 桿狀病毒的分類
        1.1.3 桿狀病毒的侵染周期
        1.1.4 桿狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白
        1.1.5 λ-Red同源重組及其在桿狀病毒中的應(yīng)用
        1.1.6 桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)
        1.1.7 病毒侵染宿主的研究進(jìn)展
    1.2 桿狀病毒Ac MNPV的基因:ac132
        1.2.1 ac132概述
        1.2.2 Ac132的相關(guān)研究
    1.3 桿狀病毒與宿主肌動蛋白
        1.3.1 桿狀病毒侵染與宿主肌動蛋白
        1.3.2 桿狀病毒運(yùn)輸與宿主肌動蛋白
    1.4 桿狀病毒侵染與宿主細(xì)胞能量代謝
    1.5 桿狀病毒的發(fā)展前景
    1.6 論文的設(shè)計(jì)思路
        1.6.1 研究內(nèi)容與意義
        1.6.2 研究方法及流程
        1.6.3 實(shí)驗(yàn)流程
        1.6.4 研究創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 重組桿狀病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的構(gòu)建及Ac132-EGFP的表達(dá)分析
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 主要試劑及其配置
        2.2.3 細(xì)胞、病毒、菌株及載體
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 重組病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP和AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP的構(gòu)建
        2.3.2 重組病毒Ac MNPV-Ac132-EGFP的構(gòu)建
        2.3.3 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代及凍存
        2.3.4 重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞
        2.3.5 噬斑法測定重組病毒的滴度
        2.3.6 Western blot及熒光顯微鏡觀察分析Ac132-EGFP的表達(dá)量
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 重組病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP的構(gòu)建
        2.4.2 重組病毒AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP的構(gòu)建
        2.4.3 重組病毒Ac MNPV-Ac132-EGFP的構(gòu)建
        2.4.4 重組病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的獲得
        2.4.5 重組病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的滴度
        2.4.6 熒光顯微鏡和Western blot檢測Ac132-EGFP在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)水平
    2.5 討論
第三章 Ac132在AcMNPV侵染宿主細(xì)胞過程中的功能分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 主要試劑及其配制
        3.2.3 載體、菌株、細(xì)胞、病毒
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.2 Western blot檢測Ac132-EGFP在細(xì)胞核中的積累
        3.3.3 Ac132蛋白的核定位信號序列預(yù)測分析
        3.3.4 重組突變型病毒的構(gòu)建
        3.3.5 重組突變型桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞
        3.3.6 噬斑法測定重組突變型病毒的滴度
        3.3.7 噬斑法檢測重組病毒子代病毒的增殖
        3.3.8 熒光顯微鏡觀察重組病毒對F-actin進(jìn)和出細(xì)胞核的影響
        3.3.9 Western blot檢測重組病毒對 β-actin在細(xì)胞核內(nèi)的聚集
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP侵染Sf9細(xì)胞中Ac132-EGFP在細(xì)胞核的積累
        3.4.2 突變病毒AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP的構(gòu)建
        3.4.3 突變病毒Ac MNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP的構(gòu)建
        3.4.4 重組突變病毒的獲得
        3.4.5 重組突變病毒的滴度
        3.4.6 各種重組病毒子代病毒增殖的分析
        3.4.7 熒光顯微鏡觀察各種重組病毒對F-actin進(jìn)和出細(xì)胞核的影響
        3.4.8 Western blot分析各種重組病毒對 β-actin在細(xì)胞核中的聚集
    3.5 討論
第四章 重組桿狀病毒對宿主細(xì)胞能量代謝的影響
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 主要試劑及其配置
        4.2.3 細(xì)胞、病毒
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.3.2 細(xì)胞種板
        4.3.3 病毒侵染
        4.3.4 葡萄糖濃度的測定
        4.3.5 乳酸濃度的測定
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 各種重組病毒侵染Sf9細(xì)胞對宿主消耗葡萄糖的影響
        4.4.2 各種重組病毒侵染Sf9細(xì)胞對宿主積累乳酸的影響
    4.5 討論
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
個人簡況及聯(lián)系方式



本文編號：3876453