發(fā)布時間：2023-12-09 11:34

　　蛋白質(zhì)糖基化是蛋白翻譯后的主要修飾過程,近來,在工業(yè)應(yīng)用中利用大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白,以獲得糖基化治療性蛋白的進(jìn)程,已有穩(wěn)步發(fā)展。細(xì)菌多糖蛋白質(zhì)綴合物的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式是化學(xué)法,多糖和蛋白質(zhì)的連接主要采用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行,使用化學(xué)方法把糖鏈添加到載體蛋白上具有生產(chǎn)過程步驟繁多,生產(chǎn)成本高,糖基化位置不確定和糖鏈數(shù)目難以控制等弊端。生物法合成可以明顯地避免這些弊端。最近,在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞質(zhì)可溶性N-糖基轉(zhuǎn)移酶(N-glycosyltransferase,NGT),它以活化的糖-核苷酸作為供體底物,將已糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)或多肽序列(N-(X(?)P)-S/T)的天冬酰胺(Asn)側(cè)鏈上。目前發(fā)現(xiàn)的NGT類酶數(shù)量有限,還未見到NGT介導(dǎo)的糖蛋白綴合物疫苗的報道�；贜GT的巨大應(yīng)用價值,理解NGT酶學(xué)性質(zhì)對糖生物學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。我們選用肺炎鏈球菌疫苗中常出現(xiàn)的肺炎鏈球菌3型,在了解NGT酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上,建立合酶依賴細(xì)菌多糖蛋白質(zhì)疫苗生產(chǎn)平臺,提供一種新的糖蛋白綴合物疫苗合成生產(chǎn)方法。拓展酶法合成合酶依賴型細(xì)菌多糖蛋白質(zhì)綴合物疫苗的應(yīng)用范圍。我們需要鑒定更多具有底物特異性的不同來源NGT同種型,...

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 生物中的N-糖基化系統(tǒng)
        1.1.1 微生物中蛋白糖基化
        1.1.2 蛋白質(zhì)的整體N-糖基化
        1.1.3 蛋白質(zhì)的連續(xù)N-糖基化
        1.1.4 糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases,GTs)
    1.2 糖綴合物疫苗
        1.2.1 細(xì)菌多糖
        1.2.2 糖蛋白
        1.2.3 細(xì)菌多糖疫苗
        1.2.4 糖綴合物疫苗
    1.3 細(xì)菌多糖合酶依賴型糖蛋白疫苗
        1.3.1 肺炎鏈球菌3型莢膜多糖
        1.3.2 肺炎鏈球菌莢膜多糖合成機(jī)制
        1.3.3 肺炎鏈球菌3型多糖合成酶(Cps3S)
第二章 不同來源的N-糖基轉(zhuǎn)移酶肽底物特異性
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑和耗材
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配置
    2.2 實驗方法
        2.2.1 不同來源NGT的序列比對
        2.2.2 不同來源的NGT的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.3 不同來源的NGT的純化
        2.2.4 不同來源NGT的檢測
        2.2.5 不同來源的NGT蛋白濃度的測定
        2.2.6 不同來源NGT體外酶活的測定
        2.2.7 KkNGT酶學(xué)性質(zhì)的測定
        2.2.8 不同來源NGT肽底物特異性的比較
        2.2.9 BtNGT的C末端缺失突變體(BtNGTct)的探究
            2.2.9.1. 質(zhì)粒pET22b
            2.2.9.2. C末端缺失突變體的目的基因的獲得
            2.2.9.3. 構(gòu)建載體pET22b- BtNGTct
            2.2.9.4. BtNGT C末端截短對糖供體的影響
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 NGT的鑒定
        2.3.2 不同來源NGT的純化與檢測
        2.3.3 不同來源NGT酶活測定
        2.3.4 KkNGT酶學(xué)性質(zhì)的測定
        2.3.5 不同來源NGT肽底物特異性的比較
        2.3.6 BtNGT的C末端缺失突變體(BtNGTct)的探究
    2.4 討論
第三章 基于NGT糖基化途徑的蛋白N-糖基化修飾
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株和載體
        3.1.2 主要試劑和耗材
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配置
    3.2 實驗方法
        3.2.1 構(gòu)建株E. coli DH5α(pET28a-CRM197-AaNGT)
        3.2.2 pET28a-CRM197-AaNGT重組子的表達(dá)及純化
        3.2.3 糖基化蛋白CRM197的Western-Blot驗證
        3.2.4 MALDI-TOF鑒定分析重組蛋白的糖基化
        3.2.5 構(gòu)建菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)
        3.2.6 單糖基化FHT-Glc蛋白的表達(dá)及純化
        3.2.7 重組蛋白的糖基化鑒定分析
        3.2.8 α-1,6-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(α1,6GlcT)的應(yīng)用
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 菌株E. coli DH5α (pET28a-CRM197-AaNGT)的驗證
        3.3.2 pET28a-CRM197-AaNGT重組子的表達(dá)及純化
        3.3.3 重組蛋白CRM197糖基化的MALDI-TOF鑒定分析
        3.3.4 菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)的驗證
        3.3.5 FHT及單糖基化蛋白FHT-Glc的表達(dá)及純化
        3.3.6 FHT及FHT-Glc的MALDI-TOF鑒定分析
        3.3.7 α-1,6-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(α1,6GlcT)的應(yīng)用
    3.4 討論
第四章 肺炎鏈球菌3型細(xì)菌胞外多糖合成酶初步探究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑和耗材
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配置
    4.2 實驗方法
        4.2.1 Cps3S的表達(dá)及純化
        4.2.2 Cps3S跨膜端缺失后的載體構(gòu)建與表達(dá)純化
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 Cps3S的表達(dá)及純化
        4.3.2 Cps3S跨膜端缺失后的載體構(gòu)建
        4.3.3 Cps3S跨膜端缺失后的表達(dá)純化
    4.4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：3871492