基因編輯作為生物工程中重要技術(shù)之一,在基礎(chǔ)研究、臨床治療、遺傳育種、生態(tài)多樣性等方面得到廣泛的應(yīng)用。新型人工核酸內(nèi)切酶CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn),大大提高了基因編輯的效率。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因功能缺失方面表現(xiàn)出高效、精準(zhǔn)的編輯作用。同時CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用過程中的易操作性、低成本性等優(yōu)勢,也使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以作為基因敲除文庫的基礎(chǔ)技術(shù),支撐全基因組高通量的篩選工作。目前,依賴人工設(shè)計、合成guide RNA并構(gòu)建guide RNA文庫的建庫策略,已實現(xiàn)小鼠、人等物種的基因組敲除文庫的構(gòu)建。然而大規(guī)模高通量合成過程中,人工操作與成本是不可忽略的。同時guide RNA設(shè)計受到物種基因組注釋程度的嚴重制約,對于注釋程度低的物種,所設(shè)計的基因組范圍的guide RNA覆蓋度大受影響。設(shè)計一個高效、非合成的高覆蓋度guide RNA文庫的建庫策略,對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的敲除文庫的構(gòu)建至關(guān)重要。目前已有報道關(guān)于利用酶處理方式進行文庫構(gòu)建的建庫策略,但研究中仍存在一些問題尚待解決,包括敲除文庫搭載體系、guide RNA片段來源、篩選應(yīng)用局...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)
        1.1.1 CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 CRISPR系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 CRISPR系統(tǒng)的類型
        1.1.4 CRISPR系統(tǒng)的作用機制
    1.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯
        1.2.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯原理
        1.2.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與哺乳動物基因編輯
        1.2.3 多途徑介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.2.4 Cas9 變體及其應(yīng)用
        1.2.5 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的比較
        1.2.6 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用的局限性
    1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的敲除文庫及應(yīng)用
        1.3.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的敲除文庫
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的敲除文庫構(gòu)建策略
        1.3.3 傳統(tǒng)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的敲除文庫構(gòu)建方法的局限性
    1.4 非合成策略構(gòu)建基因組敲除文庫
        1.4.1 酶處理策略構(gòu)建基因組敲除文庫
        1.4.2 隨機斷裂處理策略構(gòu)建基因組敲除文庫
        1.4.3 非合成策略構(gòu)建敲除文庫的優(yōu)勢
        1.4.4 非合成策略構(gòu)建敲除文庫的待優(yōu)化條件
    1.5 酶處理策略的相關(guān)限制性內(nèi)切酶
        1.5.1 TypeIIS型限制性內(nèi)切酶及其應(yīng)用
        1.5.2 限制性內(nèi)切酶MspI及其應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 限制性內(nèi)切酶
        2.1.4 主要試劑及試劑盒
        2.1.5 常用試劑配制
        2.1.6 主要生物信息分析軟件及網(wǎng)站
    2.2 實驗方法
        2.2.1 常規(guī)分子實驗方法
        2.2.2 常規(guī)細胞實驗方法
        2.2.3 酶切-三級文庫策略構(gòu)建敲除文庫方法
        2.2.4 檢測分析
        2.2.5 高通量測序數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除效率驗證
        3.1.1 PKpG細胞系的獲得及特征鑒定
        3.1.2 針對EGFP的 guide RNA設(shè)計及載體構(gòu)建
        3.1.3 EGFP基因敲除效率驗證流程及效率檢測
        3.1.4 短guide RNA對 EGFP基因敲除效率的影響
    3.2 酶處理策略構(gòu)建CRISPR/Cas9 敲除文庫的探索與優(yōu)化
        3.2.1 酶切-接頭法的敲除文庫構(gòu)建策略及建庫初探
        3.2.2 限制性內(nèi)切酶MmeI的反應(yīng)條件
        3.2.3 酶切-三級文庫法的敲除文庫構(gòu)建策略探索與優(yōu)化
    3.3 酶切-三級文庫法構(gòu)建敲除文庫——以pEGFP-C1 質(zhì)粒為例
        3.3.1 敲除文庫構(gòu)建流程
        3.3.2 一級文庫f.MspI文庫的構(gòu)建及檢測
        3.3.3 二級文庫PAM-F文庫的構(gòu)建及檢測
        3.3.4 三級文庫lenti文庫的構(gòu)建及檢測
        3.3.5 針對pEGFP-C1 質(zhì)粒的敲除文庫驗證流程
        3.3.6 針對pEGFP-C1 質(zhì)粒的敲除文庫效率的驗證
    3.4 酶切-三級文庫法構(gòu)建敲除文庫——以小鼠、豬基因組為例
        3.4.1 針對小鼠、豬基因組敲除文庫的構(gòu)建流程
        3.4.2 針對小鼠、豬基因組的f.MspI文庫構(gòu)建
        3.4.3 針對小鼠、豬基因組的PAM-F文庫及l(fā)enti文庫構(gòu)建
4 討論
    4.1 酶切-三級文庫建庫策略的可行性分析
        4.1.1 建庫結(jié)果分析
        4.1.2 建庫策略的普適性分析
    4.2 酶切-三級文庫策略的優(yōu)勢
        4.2.1 與合成策略比較
        4.2.2 與酶處理策略相關(guān)研究比較
        4.2.3 MspI介導(dǎo)的PAM定位優(yōu)勢
    4.3 酶切-三級文庫策略的不足
        4.3.1 MspI識別位點的局限性
        4.3.2 對非編碼區(qū)的敲除效率
    4.4 展望
        4.4.1 敲除文庫的篩選應(yīng)用
        4.4.2 待優(yōu)化的建庫策略
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3869066