解旋酶是一類以ATP依賴的方式來催化破壞DNA或RNA之間的氫鍵的分子馬達蛋白,參與細胞內(nèi)多種代謝過程。Pif1解旋酶是廣泛存在于病毒、原核和真核生物中的5’-3’方向解旋的SF1B解旋酶成員,近年來關(guān)于Pif1解旋酶的研究成果逐漸增多,得到了很多結(jié)構(gòu)方面的數(shù)據(jù),為理解Pif1解旋酶的工作機理和生物學功能提供了很多依據(jù)。2016年本實驗室Chen et al.發(fā)表來自物種Bacteroides spp的Pif1解旋酶的BsPif1-AMPPNP,BsPif1-ADP,BsPif1-ADP-AlF₃-ssDNA復(fù)合體三級晶體結(jié)構(gòu),建立了BsPif1-dsDNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)模型并提出BsPif1解旋dsDNA的工作機理。但是BsPif1作為一種特異性的G-四鏈體DNA(G4 DNA)解旋酶,它是如何解開G4 DNA,解旋G4 DNA的區(qū)域在何處,與G4 DNA相互作用的特異性位點有哪些,這些信息都是未知的。故我們對BsPif1繼續(xù)進行深入研究,期望能夠得到BsPif1與G4 DNA的復(fù)合體結(jié)構(gòu),深入研究BsPif1與G4 DNA之間的相互作用,找到BsPif1與G4 D...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 解旋酶
        1.1.1 解旋酶概述
        1.1.2 解旋酶的分類
    1.2 Pif1 解旋酶及其研究進展
        1.2.1 Pif1 解旋酶研究進展
        1.2.2 BsPif1 解旋酶研究進展
    1.3 G4 DNA概述
    1.4 解旋酶的研究方法
        1.4.1 電泳遷移凝膠阻滯(EMSA)
        1.4.2 熒光各向異性(Fluorescence Anisotropy,FA)
        1.4.3 快速停留熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(stopped-flow FRET)
        1.4.4 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(smFRET)
    1.5 本研究的目的與意義
第二章 BsPif1 解旋酶與G4 DNA/dsDNA復(fù)合體結(jié)晶實驗
    2.1 實驗材料、儀器、試劑
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 實驗儀器
        2.1.3 實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表達純化
        2.2.2 核酸底物的制備
        2.2.3 BsPif1 解旋酶與G4 DNA/dsDNA復(fù)合體的檢測
        2.2.4 BsPif1 解旋酶與G4 DNA/dsDNA復(fù)合體的結(jié)晶
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表達純化結(jié)果
        2.3.2 核酸底物的制備結(jié)果
        2.3.3 BsPif1 解旋酶與G4 DNA/dsDNA復(fù)合體的檢測
        2.3.4 BsPif1 解旋酶與G4 DNA/ds DNA的晶體初篩結(jié)果
    2.4 討論
第三章 BsPif1 解旋酶與G4 DNA互作的特異性位點研究
    3.1 實驗材料、儀器、試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗儀器
        3.1.3 實驗試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 BsPif1 解旋酶特異性突變位點的設(shè)計
        3.2.2 BsPif1 解旋酶突變體蛋白的載體構(gòu)建與表達純化
        3.2.3 核酸底物的制備
        3.2.4 熒光各向異性法測定BsPif1 位點突變對DNA結(jié)合親和力的影響
        3.2.5 Stopped-flow FRET測定BsPif1 位點對DNA解旋活性的影響
        3.2.6 smFRET測定BsPif1 位點突變對DNA解旋活性的影響
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 BsPif1 解旋酶突變體蛋白的載體構(gòu)建結(jié)果
        3.3.2 BsPif1 解旋酶突變體蛋白的表達純化結(jié)果
        3.3.3 核酸底物的制備結(jié)果
        3.3.4 熒光各向異性法分析BsPif1 位點突變對DNA結(jié)合親和力的影響
        3.3.5 Stopped-flow FRET分析BsPif1 位點突變對解旋G4 DNA活性的影響
        3.3.6 smFRET分析BsPif1 位點突變對解旋G4 DNA活性的影響
    3.4 討論
討論與展望
附錄
參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3869067