藍藻Synechococcus elongatus PCC 7942(S.elongatus PCC 7942)是研究生物鐘節(jié)律性的最簡單模式生物之一,其基因組中絕大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄活動都受到內(nèi)源生物鐘的調(diào)控。Kai ABC基因簇編碼了該種藍藻生物鐘核心震蕩器的基本分子組件,在藍藻生物鐘節(jié)律性的分子調(diào)控過程中起著至關重要作用。溫度補償特性是所有已知生物鐘模型的基本屬性之一,人們在以藍藻S.elongatus PCC 7942為對象的生物鐘節(jié)律性研究中發(fā)現(xiàn),溫度補償屬性的產(chǎn)生與維持往往與Kai基因家族的功能緊密相關。本實驗室在前期工作中篩選得到一個Kai ABC基因簇序列完好,但生物節(jié)律性溫度補償屬性表型為溫度條件型的藍藻突變體nktc1(Non-Kai Thermo-regulatory Component 1)。本論文以實驗室保存的藍藻S.elongatus PCC7942的nktc1突變體為對象采取基因工程方法對其溫度補償異常表型的分子機制進行了初步探究。本論文的具體研究內(nèi)容如下:1.首先基于基因組測序和基因克隆的方法確定了nktc1的突變位點。相關實驗結(jié)果表明nktc1突變體的準確...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 藍藻生物鐘研究進展
        1.1.1 藍藻生物鐘Kai核心震蕩器的研究進展
        1.1.2 藍藻Kai生物鐘的離體震蕩研究進展
        1.1.3 與Kai生物節(jié)律性震蕩器相關的其他生物鐘組件研究進展
    1.2 溫度信號在藍藻生物鐘運轉(zhuǎn)調(diào)控中作用的研究進展
        1.2.1 環(huán)境溫度信號可以影響生物鐘相位牽引的過程
        1.2.2 生物鐘節(jié)律性的溫度補償特性研究進展
        1.2.3 環(huán)境溫度條件對生物節(jié)律性的限制作用研究進展
    1.3 非Kai生物鐘溫度調(diào)控因子突變體nktc1(Non-Kai thermo-regulatory component,nktc1)
    1.4 本論文的主要研究內(nèi)容
第二章 nktc1藍藻突變體突變位點的確定
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
            2.2.1.1 實驗材料
            2.2.1.2 主要試劑
            2.2.1.3 主要儀器設備
        2.2.2 方法
            2.2.2.1 全基因組測序初步檢測和定位nktc1突變體的突變位點
            2.2.2.2 使用基因工程手段對基因組測序結(jié)果進行克隆測序,并驗證其真實性
                2.2.2.2.1 分子克隆中用到的引物
                2.2.2.2.2 目的基因片段的PCR擴增體系及程序
                2.2.2.2.3 PCR產(chǎn)物的測序和在線序列信息比對
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 nktc1突變體基因組中的突變位點分析
            2.3.1.1 nktc1突變體藍藻全基因組測序發(fā)現(xiàn)的潛在突變位點分析
            2.3.1.2 誘變親本藍藻S149全基因組測序SNP位點分析
            2.3.1.3 全基因組測序結(jié)果的比較分析
        2.3.2 假定nktc1突變位點的分子克隆及測序驗證
            2.3.2.1 不同藻株中CikA基因表達框序列比對結(jié)果
                2.3.2.1.1 藍藻數(shù)據(jù)庫收錄的野生型CikA基因表達框序列
                2.3.2.1.2 藍藻S149經(jīng)PCR克隆得到的CikA基因表達框序列
                2.3.2.1.3 nktc1 突變體中經(jīng)PCR克隆得到的nktc-cikA突變基因ORF序列測序結(jié)果
            2.3.2.2 不同藻株中RpaA序列測序結(jié)果
                2.3.2.2.1 藍藻數(shù)據(jù)庫收錄的野生型RpaA基因序列
                2.3.2.2.2 基因克隆測序得到S149內(nèi)RpaA序列
                2.3.2.2.3 基因克隆測序得到nktc1內(nèi)PCR克隆測序結(jié)果如下RpaA序列
    2.4 討論
第三章 nktc1 突變回復藍藻藻株的基因工程構(gòu)建及單一nktc位點突變重構(gòu)藻株的獲得
    3.1 引言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗方法
            3.2.2.1 攜帶nktc-cikA突變位點的藍藻轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
            3.2.2.2 攜帶nktc-rpaA突變位點的藍藻轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
            3.2.2.3 nktc-cikA突變原位回復載體的構(gòu)建
            3.2.2.4 nktc-rpaA突變原位回復載體的構(gòu)建
            3.2.2.5 突變重建藍藻藻株和突變回復藍藻藻株的獲得
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 nktc-cikA或 nktc-rpaA突變位點重建載體及nktc突變位點回復載體的構(gòu)建
            3.3.1.1 nktc-cikA突變重建載體的構(gòu)建及nktc-cikA突變位點重構(gòu)藍藻藻株的驗證
            3.3.1.2 nktc-rpaA突變重建載體的構(gòu)建及nktc-rpaA突變位點重構(gòu)藍藻藻株的驗證
            3.3.1.3 nktc-cikA突變原位回復載體19T-CikA-R的構(gòu)建
            3.3.1.4 nktc-rpaA突變原位回復載體19T-RpaA-R的構(gòu)建
            3.3.1.5 nktc1 突變體的異位回復株系NS-CikA-R和 NS-RpaA-R及異位雙回復株系的NS-CikA-RpaA-R的驗證
    3.4 討論
第四章 nktc-cikA和 nktc-rpaA突變對藍藻生物鐘節(jié)律性溫度補償表型的影響分析
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
            4.2.1.1 實驗材料
            4.2.1.2 主要試劑
            4.2.1.3 主要儀器設備
        4.2.2 實驗方法
            4.2.2.1 RT-qPCR檢測KaiC基因在不同藍藻株系中的時序表達模式
                4.2.2.1.1 不同藍藻株系在溫度馴化條件下時序樣本的收集
                4.2.2.1.2 TRIzol法進行總RNA的提取
                4.2.2.1.3 基因組DNA的去除及c DNA的合成與純化
                4.2.2.1.4 RT-qPCR實驗引物設計
            4.2.2.2 Western Blot檢測KaiC蛋白磷酸化節(jié)律性在不同藍藻藻株中的表型
                4.2.2.2.1 用于Western Blot實驗蛋白提取的藍藻時序樣本收集
                4.2.2.2.2 藍藻蛋白的提取
                4.2.2.2.3 蛋白電泳
                4.2.2.2.4 Western blot
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 KaiC基因在野生型藍藻S149中的表達模式分析
            4.3.1.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在野生型藍藻S149 中的節(jié)律性表達模式
            4.3.1.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍藻S149時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.2 KaiC基因在藍藻nktc-cikA-m中的表達模式分析
            4.3.2.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻nktc-cikA-m中的節(jié)律性表達模式
            4.3.2.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍藻nktc-cikA-m時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.3 KaiC基因在野生型藍藻nktc-rpaA-m中的表達模式分析
            4.3.3.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻nktc-rpaA-m中的節(jié)律性表達模式
            4.3.3.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍藻nktc-rpaA-m時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.4 KaiC基因在nktc1 突變藻株中的表達模式分析
            4.3.4.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在nktc1 突變藻株中的節(jié)律性表達模式
            4.3.4.2 25℃/30℃低溫溫度馴化nktc1 突變藻株時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.5 KaiC基因在藍藻19T-CikA-R中的表達模式分析
            4.3.5.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻19T-CikA-R中的節(jié)律性表達模式
            4.3.5.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍藻19T-CikA-R時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.6 KaiC基因在藍藻19T-RpaA-R中的表達模式分析
            4.3.6.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻19T-RpaA-R中的節(jié)律性表達模式
            4.3.6.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍藻19T-RpaA-R時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.7 KaiC基因在藍藻NS-CikA-R中的表達模式分析
            4.3.7.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻NS-CikA-R中的節(jié)律性表達模式
            4.3.7.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍藻NS-CikA-R時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.8 KaiC基因在藍藻NS-RpaA-R中的表達模式分析
            4.3.8.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻NS-RpaA-R中的節(jié)律性表達模式
            4.3.8.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍藻NS-RpaA-R時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
        4.3.9 KaiC基因在藍藻NS-CikA-RpaA-R中的表達模式分析
            4.3.9.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍藻NS-CikA-RpaA-R中的節(jié)律性表達模式
            4.3.9.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍藻NS-CikA-RpaA-R時序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
    4.4 討論
結(jié)論
參考文獻
攻讀碩士學位期間取得的科研成果
致謝



本文編號：3866631