旨在獲得更為高效穩(wěn)定的GoldenBraid(GB)酶切連接組裝反應(yīng)體系。通過優(yōu)化GB反應(yīng)中酶切時間、緩沖體系、限制性內(nèi)切酶和底物配伍來提高有效克隆的效率,確定最佳反應(yīng)體系。結(jié)果顯示,4 min酶切時間,1 μL FastDigest Buffer(10×)緩沖體系,1 mmol/L ATP,0.5 μL FastDigest Esp3I 或FastDigest Eco31I,元件供體載體與受體載體的摩爾比3∶1時,有效克隆比例接近99%,是優(yōu)化前(BsmBI 8%、BsaI 23%)的4倍以上,此時酶切連接效率接近100%。與原始方案相比,通過體系的優(yōu)化,可以在更少內(nèi)切酶用量(原方案為1 μL)的情況下,顯著提高有效克隆比例,表明本方法能提高GB系統(tǒng)的酶切連接效率和實用性。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.1.2 酶和試劑
    1.2 方法
        1.2.1 限制連接組裝反應(yīng)
        1.2.2 GB反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        1.2.3 GB反應(yīng)評價方法
        1.2.4 GB反應(yīng)優(yōu)化實驗
            1.2.4.1 酶切時間對GB反應(yīng)的影響
            1.2.4.2 緩沖體系對GB反應(yīng)的影響
            1.2.4.3 限制性內(nèi)切酶對GB反應(yīng)的影響
            1.2.4.4 底物配伍對GB反應(yīng)的影響
2 結(jié)果
    2.1 酶切時間對酶切連接效率的影響
    2.2 緩沖體系對酶切連接效率的影響
    2.3 不同來源限制性內(nèi)切酶對酶切連接效率的影響
    2.4 底物配伍對酶切連接效率的影響
3 討論
4 結(jié)論



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