蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白具有很好的殺蟲(chóng)效果,其中Cry5B和Cry6A較為典型。Cry6A在結(jié)構(gòu)上與其他的伴胞晶體蛋白有較大不同,且作用機(jī)制新穎。新穎的作用方式預(yù)示著線(xiàn)蟲(chóng)可能對(duì)該毒素存在不同的免疫應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)存在三個(gè)pmk基因pmk-(1-3),它們連續(xù)排列組成一個(gè)操縱子;而PMK-2與PMK-1同源性很高,主要表達(dá)于線(xiàn)蟲(chóng)神經(jīng)細(xì)胞中。我們前期研究結(jié)果顯示PMK-2與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)Cry6A晶體蛋白毒素防御反應(yīng)相關(guān),對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生存具有重要意義�；谏鲜鲅芯炕A(chǔ),本課題對(duì)有無(wú)Cry6A毒素作用野生型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較分析,進(jìn)一步篩選PMK-2信號(hào)途徑調(diào)控的靶標(biāo)基因,從而揭示PMK-2信號(hào)通路介導(dǎo)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)Cry6A晶體蛋白防御反應(yīng)的分子機(jī)制。PMK-1能被上游激酶NSY-1和SEK-1所激活,且pmk-1和pmk-2位于同一操縱子上,本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)Western blotting證明Cry6A不能使突變體sek-1(km4)和nsy-1(ag3)的PMK-2發(fā)生磷酸化,說(shuō)明NSY-1和SEK-1也是磷酸化激活PMK-2的上游激酶。已有研究表明在受到Cry5B...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)
    2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)活性研究
    3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)免疫應(yīng)答調(diào)控系統(tǒng)
        3.1 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
        3.2 胰島素樣信號(hào)通路
        3.3 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
    4 線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)Bt晶體蛋白毒素免疫應(yīng)激反應(yīng)
    5 立題依據(jù)及意義
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 供試菌株
        1.2 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)
        1.3 載體
        1.4 培養(yǎng)基
        1.5 抗體
        1.6 PCR引物合成
        1.7 試劑盒和相關(guān)試劑
            1.7.1 試劑盒
            1.7.2 相關(guān)溶液配制
        1.8 主要儀器設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 Cry6A毒素對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)PMK-1/2 磷酸化水平的影響
            2.1.1 Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry6A、Cry5B的純化
            2.1.2 毒素作用線(xiàn)蟲(chóng)處理
            2.1.3 Western blot檢測(cè)磷酸化水平
        2.2 PMK-2 蛋白的可溶性檢測(cè)
            2.2.1 PMK-2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.2 菌體的超聲破碎
            2.2.3 SDS-PAGE電泳鑒定融合蛋白的可溶性
        2.3 ttm-2 突變體構(gòu)建
            2.3.1 C.elegans總 RNA的提取
            2.3.2 ttm-2 基因干擾載體的構(gòu)建
            2.3.3 ttm-2 基因的RNA干擾實(shí)驗(yàn)
            2.3.4 RNAi線(xiàn)蟲(chóng)ttm-2 基因干擾效果檢測(cè)
        2.4 Cry6A,Cry5B對(duì) ttm-1,ttm-2 突變體的毒力敏感測(cè)定
        2.5 Cry6A對(duì)野生型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
            2.5.1 Cry6A蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
            2.5.2 Cry6A蛋白作用于野生型線(xiàn)蟲(chóng)
第三章 結(jié)果與分析
    1 Cry6A晶體蛋白毒素對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)突變體PMK-1/2磷酸化水平的影響
        1.1 Cry6A,Cry5B晶體蛋白的提取純化
        1.2 sek-1和nsy-1是PMK-2 上游激酶
    2 PMK-2 蛋白的可溶性檢測(cè)
        2.1 PMK-2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2 PMK-2 蛋白的可溶性鑒定
    3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ttm-2 基因的RNA干擾
        3.1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取
        3.2 ttm-2 基因的RNA干擾載體的構(gòu)建
        3.3 ttm-2 重組菌株喂食線(xiàn)蟲(chóng)
        3.4 ttm-2 基因干擾效果
    4 Cry6A,Cry5B晶體蛋白對(duì)野生型N2及ttm-1,ttm-2 突變體的毒力作用
    5 Cry6A毒素處理野生型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)RNA-seq數(shù)據(jù)分析
        5.1 Cry6A蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.2 Cry6A對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)情況的影響
        5.3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)
        5.4 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)
        5.5 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異基因表達(dá)分析
        5.6 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在Cry6A毒素處理下差異表達(dá)基因GO分類(lèi)
        5.7 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在毒素處理?xiàng)l件下的KEGG pathway分析
        5.8 差異基因的功能分析
    6 利用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)差異基因在轉(zhuǎn)錄水平上的差異
        6.1 pmk-2 基因干擾效果檢測(cè)
        6.2 利用qRT-PCR檢測(cè)處理和對(duì)照組秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中11 種差異基因轉(zhuǎn)錄情況
        6.3 Cry6A使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ATP含量上升
        6.4 Cry6A對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)突變體的毒力作用
第四章 討論
    1 Cry6A對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的作用
    2 MAPK下游調(diào)控多種能量相關(guān)蛋白
    3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)能量代謝分析
第五章 結(jié)論
    1 PMK-2與PMK-1共用上游激酶SEK-1和NSY-1
    2 PMK-2 不與PMK-1 共用下游靶標(biāo)TTM-1和TTM-2
    3 通過(guò)RNA-seq確定了一些與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)防御Cry6Aa2 毒素相關(guān)的途徑和蛋白
參考文獻(xiàn)
論文發(fā)表情況
課題受資助的基金項(xiàng)目
致謝



本文編號(hào)：3824438