目的:在小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cell,mESC)中,基于抗壞血酸過(guò)氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase,APEX2)的鄰近標(biāo)記技術(shù)和質(zhì)譜鑒定核仁相關(guān)蛋白。方法:構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)APEX2-FBL細(xì)胞系,通過(guò)APEX2鄰近標(biāo)記技術(shù)獲得生物素標(biāo)記蛋白,用鏈酶親和素包裹的磁珠對(duì)生物素標(biāo)記的蛋白進(jìn)行富集,隨后運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)鑒定,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選差異蛋白。結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)APEX2-FBL細(xì)胞系;Western blot結(jié)果顯示,通過(guò)APEX2鄰近標(biāo)記技術(shù)獲得大量生物素標(biāo)記蛋白;質(zhì)譜鑒定出837個(gè)差異蛋白,且生物學(xué)過(guò)程多與核仁相關(guān)。結(jié)論:利用鄰近生物素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析是一種可行的鑒定核仁相關(guān)蛋白的方法。

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 N2B27培養(yǎng)基配置
        1.2.2 小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)
        1.2.3 構(gòu)建PB-HA-APEX2-FBL過(guò)表達(dá)載體
        1.2.4 構(gòu)建FBL過(guò)表達(dá)細(xì)胞系
        1.2.5 細(xì)胞爬片的免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        1.2.6 基于APEX2的鄰近生物素標(biāo)記技術(shù)
        1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平
        1.2.8 生物素標(biāo)記蛋白富集與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析[12]
        1.2.9 構(gòu)建NCL-RFP基因敲入細(xì)胞系
    1.3 生物信息學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 構(gòu)建APEX2-FBL過(guò)表達(dá)的m ESC穩(wěn)定細(xì)胞系
    2.2 對(duì)FBL鄰近蛋白進(jìn)行生物素標(biāo)記
    2.3 GO分析顯示差異蛋白與核仁相關(guān)
    2.4 差異蛋白與已發(fā)表數(shù)據(jù)有交叉
    2.5 驗(yàn)證本研究鑒定的相關(guān)核仁蛋白
3 討論



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