肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)殘基與氨基葡萄糖(GlcN)殘基以1→4糖苷鍵連接而成的二糖重復(fù)單元組成的糖胺聚糖,因糖鏈長短不一、各糖單元存在可變的硫酸化、異構(gòu)化等修飾,使其成為分子量、精細(xì)結(jié)構(gòu)不均一的多組分混合物,并表現(xiàn)出多種多樣的生物活性。作為有機合成中最具挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域之一,國內(nèi)外多個研究小組已成功發(fā)展了許多肝素/HS寡糖合成的新方法和策略,實現(xiàn)了特定結(jié)構(gòu)肝素寡糖的定向合成,但現(xiàn)有單純化學(xué)合成策略存在反應(yīng)步數(shù)多、合成效率極低等不足。課題組前期通過模擬肝素的體內(nèi)生物合成途徑,成功發(fā)展了一種以多酶催化反應(yīng)為主的、溫和的化學(xué)方法為輔的化學(xué)酶法合成方法,這種全新的技術(shù)具有步驟少、產(chǎn)率高等優(yōu)點,被認(rèn)為是最具有發(fā)展前途的肝素寡糖合成策略。因此,本課題以之前建立的化學(xué)酶法合成技術(shù)為基礎(chǔ),有針對性地引入溫和的化學(xué)修飾方法對合成特定寡糖進行N-脫硫酸化修飾以突破修飾酶對底物識別的限制,從而構(gòu)建結(jié)構(gòu)更加豐富的肝素寡糖化合物庫。此外,肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)產(chǎn)生的肝素酶Ⅰ(hepari...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略詞及符號說明表
第一章 前言
    1. 肝素
        1.1 肝素和硫酸乙酰肝素的結(jié)構(gòu)特征
        1.2 肝素/HS的功能概況
            1.2.1 抗凝活性
            1.2.2 抗腫瘤活性
            1.2.3 抗炎活性
            1.2.4 抗病毒活性
        1.3 肝素/HS寡糖的合成概況
            1.3.1 化學(xué)合成法
            1.3.2 化學(xué)酶法合成
    2. 肝素酶
        2.1 肝素酶的來源和種類
        2.2 肝素酶的應(yīng)用
            2.2.1 體外循環(huán)中消除肝素
            2.2.2 生產(chǎn)低分子肝素
            2.2.3 研究肝素的精細(xì)結(jié)構(gòu)
            2.2.4 其他
        2.3 肝素酶研究存在的問題及展望
    3. 本課題研究的目的和意義
        3.1 前期研究工作
        3.2 本課題擬解決的關(guān)鍵問題
第二章 糖基供體與硫酸基供體的制備
    1. 糖基供體的制備
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗試劑與耗材
            1.1.2 實驗儀器
        1.2 實驗方法
            1.2.1 UDP-GlcA的合成
        1.3 實驗結(jié)果
            1.3.1 UDP-GlcA的合成、純化及鑒定
        1.4 UDP-GlcNTFA的合成、純化及鑒定
            1.4.1 GIcNTFA的合成
            1.4.2 NahK、GlmU、PPA的提取及純化
            1.4.3 UDP-GlcNTFA的合成、純化及鑒定
        1.5 實驗結(jié)果
            1.5.1 UDP-GIcNTFA的合成、純化及鑒定
    2. 硫酸基供體PAPS的制備
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗試劑與耗材
            2.1.2 實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 重組KAST-APSK的制備
            2.2.2 PAPS的合成
            2.2.3 PAPS的純化及鑒定
        2.3 實驗結(jié)果
            2.3.1 PAPS的合成、純化及鑒定
    3. 討論
    4. 本章小結(jié)
第三章 肝素寡糖的合成及結(jié)構(gòu)鑒定
    1. 寡糖骨架合成
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗試劑與耗材
            1.1.2 實驗儀器
        1.2 實驗方法
            1.2.1 KfiA和PmHS2酶的制備
            1.2.2 寡糖骨架合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        1.3 結(jié)果與分析
            1.3.1 骨架合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
    2. N-硫酸化修飾
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗試劑與耗材
            2.1.2 實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 NST酶的制備
            2.2.2 N-硫酸化肝素五糖的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        2.3 結(jié)果與分析
            2.3.1 N-硫酸化肝素五糖的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
    3. C₅異構(gòu)化和C₅異構(gòu)化/2-O硫酸化修飾
        3.1 實驗材料
            3.1.1 實驗試劑與耗材
            3.1.2 實驗儀器
        3.2 實驗方法
            3.2.1 C₅-epi和2-OST酶的制備
            3.2.2 Penta-NS-IdoA的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            3.2.3 Penta-NS-IdoA2S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        3.3 結(jié)果與分析
            3.3.1 Penta-NS-IdoA的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            3.3.2 Penta-NS-IdoA2S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
    4. 6-O-硫酸化修飾
        4.1 實驗材料
            4.1.1 實驗試劑與耗材
            4.1.2 實驗儀器
        4.2 實驗方法
            4.2.1 6-OST-1/3酶的制備
            4.2.2 Penta-NS6S的合成
            4.2.3 Penta-NS6S-IdoA的合成
            4.2.4 Penta-NS6S-IdoA2S的合成
            4.2.5 6-O-硫酸化肝素五糖的純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        4.3 結(jié)果與分析
            4.3.1 Penta-NS6S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            4.3.2 Penta-NS6S-IdoA的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            4.3.3 Penta-NS6S-IdoA2S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
    5. N-脫硫酸化修飾
        5.1 實驗材料
            5.1.1 實驗試劑與耗材
            5.1.2 實驗儀器
        5.2 試驗方法
            5.2.1 N-位脫硫酸化修飾
            5.2.2 N-位脫硫酸化肝素寡糖的純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        5.3 結(jié)果與分析
            5.3.1 Penta-NH₂6S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            5.3.2 Penta-NH₂6S-IdoA的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            5.3.3 Penta-NH₂-IdoA2S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
            5.3.4 Penta-NH₂6S-IdoA2S的合成、純化及結(jié)構(gòu)鑒定
    6. 討論
    7. 本章小結(jié)
第四章 肝素酶I對肝素寡糖的催化切割模式研究
    1. 實驗材料
        1.1 實驗試劑與耗材
        1.2 實驗儀器
    2. 實驗方法
        2.1 重組肝素酶Ⅰ的制備及活性測定
        2.2 肝素寡糖底物的合成
        2.3 肝素酶Ⅰ的動力學(xué)分析
        2.4 肝素酶Ⅰ的底物特異性測定
        2.5 肝素酶Ⅰ對不同寡糖底物切割的差異
        2.6 肝素酶Ⅰ和底物之間的相互作用測定
            2.6.1 肝素酶Ⅰ的生物素化
            2.6.2 動力學(xué)測定
    3. 結(jié)果與分析
        3.1 肝素酶Ⅰ的制備及活性測定
        3.2 肝素寡糖底物的合成
        3.3 肝素酶Ⅰ的動力學(xué)分析
        3.4 肝素酶Ⅰ的底物特異性分析
            3.4.1 肝素酶Ⅰ對GlcN-UA的切割作用
            3.4.2 肝素酶Ⅰ對GlcNS6S-UA2S的切割作用
            3.4.3 肝素酶Ⅰ對GlcNS-UA2S的切割作用
            3.4.4 肝素酶Ⅰ對GlcNS6S-UA的切割作用
            3.4.5 肝素酶Ⅰ對肝素寡糖底物切割的偏好性
            3.4.6 肝素酶Ⅰ與底物相互作用的分析
    4. 討論
    5. 本章小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
    1. 全文總結(jié)
    2. 展望
參考文獻
致謝
學(xué)位論文評閱及答辯情況表



本文編號：3803130