小細胞外囊泡(Small extracellular vesicles,sEVs)是大多數(shù)細胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結構的納米級囊泡,在細胞與細胞之間的通訊中起著重要的作用。然而,由于其粒徑小、豐度小和密度低,目前存在的提取小細胞外囊泡的方法都存在或多或少不同的缺陷,小細胞外囊泡的有效分離和無損釋放仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。針對目前小細胞外囊泡分離和純化過程中存在的問題,我們設計了兩種基于Annexin V的親和磁珠,一種是使用FITC作為中間體,將Annexin V-FITC固定于抗FITC抗體磁珠上;另一種為直接將Annexin V偶聯(lián)在羧基磁珠上。這兩種磁珠分離和純化小細胞外囊泡的原理相同,均為利用磁珠表面的Annexin V以鈣離子依賴的方式與小細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸結合,從而富集磷酯酰絲氨酸陽性的小細胞外囊泡。經(jīng)磁分離后,可去除小細胞外囊泡以外的其他雜質(zhì),更重要的是,通過添加含有金屬離子螯合劑EDTA的洗脫液,磁珠富集的小細胞外囊泡可被無損傷釋放和分離。將此方法應用于從胃癌細胞MGC-803的培養(yǎng)上清液中分離和純化小細胞外囊泡,經(jīng)過NTA,TEM以及Western blot檢測...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
1 前言
    1.1 小細胞外囊泡
        1.1.1 小細胞外囊泡的形成、結構及功能
        1.1.2 小細胞外囊泡在臨床診斷及治療中的應用
    1.2 小細胞外囊泡分離方法概述
        1.2.1 超速離心法
        1.2.2 密度梯度離心法
        1.2.3 尺寸色譜排阻法
        1.2.4 沉淀法
        1.2.5 免疫磁珠法
    1.3 磷酯酰絲氨酸
    1.4 研究目的與研究策略
2 Annexin V-FITC親和磁珠的構建
    2.1 Annexin V表達純化
        2.1.1 實驗原理
        2.1.2 實驗儀器與設備
        2.1.3 實驗材料
        2.1.4 實驗溶液配制
        2.1.5 實驗方法
        2.1.6 實驗結果
    2.2 Annexin V-FITC偶聯(lián)與純化
        2.2.1 實驗原理
        2.2.2 實驗儀器與設備
        2.2.3 實驗試劑與材料
        2.2.4 實驗溶液配制
        2.2.5 實驗方法
        2.2.6 實驗結果
    2.3 Annexin V-FITC親和磁珠的構建
        2.3.1 實驗原理
        2.3.2 實驗儀器與設備
        2.3.3 實驗試劑與材料
        2.3.4 實驗方法
        2.3.5 實驗結果
    2.4 小結
3 基于Annexin V-FITC親和磁珠分離和純化小細胞外囊泡方法的建立及應用
    3.1 小細胞外囊泡的分離、純化和鑒定
        3.1.1 實驗原理
        3.1.2 實驗儀器與設備
        3.1.3 實驗試劑與材料
        3.1.4 實驗溶液配制
        3.1.5 實驗方法
        3.1.6 實驗結果
    3.2 實驗條件優(yōu)化
        3.2.1 實驗溶液配制
        3.2.2 實驗方法
        3.2.3 實驗結果
    3.3 Annexin V-FITC親和磁珠法和超速離心法分離的小細胞外囊泡的對比
        3.3.1 實驗原理
        3.3.2 實驗方法
        3.3.3 實驗結果
    3.4 Annexin V-FITC親和磁珠分離和純化的小細胞外囊泡生物活性評價
        3.4.1 實驗原理
        3.4.2 實驗儀器與設備
        3.4.3 實驗試劑與材料
        3.4.4 實驗方法
        3.4.5 實驗結果
    3.5 Annexin V-FITC親和磁珠分離和純化小細胞外囊泡的應用
        3.5.1 研究背景
        3.5.2 實驗方法
        3.5.3 實驗結果
    3.6 小結
4 基于Annexin V親和磁珠分離和純化小細胞外囊泡方法的建立及應用
    4.1 Annexin V親和磁珠的構建
        4.1.1 實驗原理
        4.1.2 實驗儀器與設備
        4.1.3 實驗試劑與材料
        4.1.4 實驗溶液配制
        4.1.5 實驗方法
        4.1.6 Annexin V-FITC親和磁珠法和Annexin V親和磁珠分離法分離的小細胞外囊泡的對比
        4.1.7 實驗結果
    4.2 小結
5 總結與展望
參考文獻
在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果
致謝



本文編號：3799798