非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是一種接觸傳染、高致死率的豬傳染病,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的疫病,病死率高達100%,給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。2018年ASF傳入我國,由于缺乏有效疫苗,已給我國養(yǎng)豬業(yè)造成無法估量的經(jīng)濟損失,嚴重影響了我國整個生豬產(chǎn)業(yè)鏈。該病的病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),ASFV為大型雙鏈DNA病毒,其全基因組在170-193 kb之間,不同毒株約包含151-167個基因不等。納米抗體(Nanobody,Nb)是存在于駱駝科動物體內(nèi),天然缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(qū)的一種單鏈抗體。該抗體具有分子量小,穩(wěn)定性高,易于基因改造的優(yōu)點,近年來已被廣泛應用于人和動物疫病的診斷和治療中。然而,關于納米抗體在ASFV診斷和防治中的應用卻一直未見相關研究報道。本研究利用原核表達ASFV-p72蛋白免疫雙峰駝,構建噬菌體文庫,通過噬菌體展示技術篩選獲得了針對p72蛋白的納米抗體。隨后,將篩選的納米抗體與辣根過氧化物酶(HRP)進行融合表達,并利用該融合蛋白建立了一種快速檢測豬血清...

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 非洲豬瘟的研究進展
        1.1.1 非洲豬瘟概述
        1.1.2 非洲豬瘟病毒特點
        1.1.3 非洲豬瘟病毒編碼的主要蛋白特點
        1.1.4 非洲豬瘟的傳播途徑和臨床癥狀
        1.1.5 非洲豬瘟的診斷
        1.1.6 非洲豬瘟疫苗
    1.2 納米抗體研究進展
        1.2.1 納米抗體的結(jié)構特征
        1.2.2 納米抗體的特性
        1.2.3 納米抗體的應用
    1.3 研究目的及意義
第二章 非洲豬瘟病毒p72蛋白的原核表達與純化
    2.1 材料
        2.1.1 儀器設備
        2.1.2 試劑耗材
    2.2 方法
        2.2.1 ASFV-p72基因的擴增
        2.2.2 ASFV-p72重組蛋白的表達純化
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 原核表達載體p ET-28a-ASFV-p72 的構建
        2.3.2 ASFV-p72 重組蛋白的表達及抗原性分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 非洲豬瘟病毒p72蛋白納米抗體庫的構建以及特異性納米抗體的篩選
    3.1 材料
        3.1.1 儀器設備
        3.1.2 試劑耗材
        3.1.3 載體和試驗動物
    3.2 方法
        3.2.1 免疫雙峰駝
        3.2.2 納米抗體文庫的構建
        3.2.3 p72蛋白特異性納米抗體的淘選
        3.2.4 p72蛋白特異性納米抗體的鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 抗p72蛋白抗體滴度測定
        3.3.2 納米抗體文庫的構建及陽性率的檢測
        3.3.3 p72重組蛋白特異性納米抗體的淘選
        3.3.4 p72蛋白特異性納米抗體的鑒定
        3.3.5 p72蛋白特異性納米抗體結(jié)合抗原能力分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 基于納米抗體-HRP融合蛋白建立豬血清中ASFV抗體競爭ELISA檢測方法
    4.1 材料
        4.1.1 儀器設備
        4.1.2 試劑耗材
    4.2 方法
        4.2.1 pEGFP-N1-ASFV-Nb4 真核表達載體的構建
        4.2.2 真核表達ASFV-p72-Nb4 蛋白
        4.2.3 驗證p72蛋白與p72-Nb4的親和力
        4.2.4 基于納米抗體的競爭ELISA方法的建立
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 p EGFP-ASFV-p72-Nb4 真核表達載體的構建
        4.3.2 p72-Nb4的表達以及與p72蛋白親和力的鑒定
        4.3.3 競爭ELISA最佳條件的確定
        4.3.4 競爭ELISA方法Cut-off值的確定
        4.3.5 敏感性評價
        4.3.6 特異性評價
        4.3.7 符合率評價
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
合作研究協(xié)議
關于同意使用生物安全三級實驗室的承諾
致謝
個人簡歷



本文編號：3795296