非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是一種接觸傳染、高致死率的豬傳染病,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的疫病,病死率高達(dá)100%,給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2018年ASF傳入我國(guó),由于缺乏有效疫苗,已給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成無(wú)法估量的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響了我國(guó)整個(gè)生豬產(chǎn)業(yè)鏈。該病的病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),ASFV為大型雙鏈DNA病毒,其全基因組在170-193 kb之間,不同毒株約包含151-167個(gè)基因不等。納米抗體(Nanobody,Nb)是存在于駱駝科動(dòng)物體內(nèi),天然缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(qū)的一種單鏈抗體。該抗體具有分子量小,穩(wěn)定性高,易于基因改造的優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物疫病的診斷和治療中。然而,關(guān)于納米抗體在ASFV診斷和防治中的應(yīng)用卻一直未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用原核表達(dá)ASFV-p72蛋白免疫雙峰駝,構(gòu)建噬菌體文庫(kù),通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選獲得了針對(duì)p72蛋白的納米抗體。隨后,將篩選的納米抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行融合表達(dá),并利用該融合蛋白建立了一種快速檢測(cè)豬血清...

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 非洲豬瘟的研究進(jìn)展
        1.1.1 非洲豬瘟概述
        1.1.2 非洲豬瘟病毒特點(diǎn)
        1.1.3 非洲豬瘟病毒編碼的主要蛋白特點(diǎn)
        1.1.4 非洲豬瘟的傳播途徑和臨床癥狀
        1.1.5 非洲豬瘟的診斷
        1.1.6 非洲豬瘟疫苗
    1.2 納米抗體研究進(jìn)展
        1.2.1 納米抗體的結(jié)構(gòu)特征
        1.2.2 納米抗體的特性
        1.2.3 納米抗體的應(yīng)用
    1.3 研究目的及意義
第二章 非洲豬瘟病毒p72蛋白的原核表達(dá)與純化
    2.1 材料
        2.1.1 儀器設(shè)備
        2.1.2 試劑耗材
    2.2 方法
        2.2.1 ASFV-p72基因的擴(kuò)增
        2.2.2 ASFV-p72重組蛋白的表達(dá)純化
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 原核表達(dá)載體p ET-28a-ASFV-p72 的構(gòu)建
        2.3.2 ASFV-p72 重組蛋白的表達(dá)及抗原性分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 非洲豬瘟病毒p72蛋白納米抗體庫(kù)的構(gòu)建以及特異性納米抗體的篩選
    3.1 材料
        3.1.1 儀器設(shè)備
        3.1.2 試劑耗材
        3.1.3 載體和試驗(yàn)動(dòng)物
    3.2 方法
        3.2.1 免疫雙峰駝
        3.2.2 納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建
        3.2.3 p72蛋白特異性納米抗體的淘選
        3.2.4 p72蛋白特異性納米抗體的鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 抗p72蛋白抗體滴度測(cè)定
        3.3.2 納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性率的檢測(cè)
        3.3.3 p72重組蛋白特異性納米抗體的淘選
        3.3.4 p72蛋白特異性納米抗體的鑒定
        3.3.5 p72蛋白特異性納米抗體結(jié)合抗原能力分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 基于納米抗體-HRP融合蛋白建立豬血清中ASFV抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法
    4.1 材料
        4.1.1 儀器設(shè)備
        4.1.2 試劑耗材
    4.2 方法
        4.2.1 pEGFP-N1-ASFV-Nb4 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 真核表達(dá)ASFV-p72-Nb4 蛋白
        4.2.3 驗(yàn)證p72蛋白與p72-Nb4的親和力
        4.2.4 基于納米抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 p EGFP-ASFV-p72-Nb4 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 p72-Nb4的表達(dá)以及與p72蛋白親和力的鑒定
        4.3.3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳條件的確定
        4.3.4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法Cut-off值的確定
        4.3.5 敏感性評(píng)價(jià)
        4.3.6 特異性評(píng)價(jià)
        4.3.7 符合率評(píng)價(jià)
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
合作研究協(xié)議
關(guān)于同意使用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的承諾
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3795296