番茄(Solanum lycopersicum)原產(chǎn)于南美洲,由于其果實(shí)營養(yǎng)豐富,具有特殊風(fēng)味,在中國廣泛栽培。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是發(fā)生在番茄上最嚴(yán)重的病害,為了防止降低產(chǎn)量,在分子水平上對此病進(jìn)行防治尤為重要。植物體內(nèi)起自我保護(hù)作用蛋白質(zhì)的合成與積累,可直接抑制病原物的生長,這類抗性蛋白質(zhì)如病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis Related Protein,PR),在其表達(dá)時,會受到長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的調(diào)控。lncRNA是一類長度大于200 nt,不具備編碼蛋白能力的線型RNA片段,目前,已有研究揭示其與植物病害相關(guān),但關(guān)于植物中影響PR-6即蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor,PI)功能相關(guān)的lncRNA未見報(bào)導(dǎo)。本研究圍繞上述問題進(jìn)行科學(xué)探究,具體過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:首先,本研究篩選出晚疫病相關(guān)的SLPI100(S.lycopersicum Protease Inhibitor 100)及位于其反義鏈上的lncRNA39042,二者均存在于番茄10號染色體...

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 番茄晚疫病的研究進(jìn)展
        1.1.1 番茄與致病疫霉
        1.1.2 番茄晚疫病的研究現(xiàn)狀
        1.1.3 番茄晚疫病的防治策略
    1.2 植物先天免疫系統(tǒng)與蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展
        1.2.1 植物先天免疫系統(tǒng)
        1.2.2 植物免疫防御過程中的病程相關(guān)蛋白
        1.2.3 植物蛋白酶抑制劑
    1.3 植物lnc RNA的概述
        1.3.1 植物lnc RNA的結(jié)構(gòu)及種類
        1.3.2 植物lnc RNA的作用方式
        1.3.3 植物lnc RNA的功能
    1.4 植物lnc RNA與基因功能的研究策略
        1.4.1 過量表達(dá)技術(shù)
        1.4.2 基因敲除技術(shù)
        1.4.3 CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù)
    1.5 本研究的目的及意義
2 lncRNA39042與SLPI100基因的篩選、克隆與生物信息學(xué)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)所用軟件、材料及試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用軟件
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 lncRNA39042與SLPI100基因的篩選
        2.2.2 lncRNA39042與SLPI100基因的啟動子元件分析
        2.2.3 番茄葉片基因組DNA的提取
        2.2.4 葉片的RNA提取與c DNA合成
        2.2.5 lncRNA39042與SLPI100的克隆
        2.2.6 SLPI100的理化性質(zhì)、多序列比對、結(jié)構(gòu)及親疏水性分析
        2.2.7 SLPI100與Pin家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 lncRNA39042與SLPI100基因的序列信息
        2.3.2 lncRNA39042與SLPI100基因的啟動子元件信息
        2.3.3 番茄葉片的基因組DNA
        2.3.4 番茄葉片的RNA
        2.3.5 lncRNA39042與SLPI100基因的克隆結(jié)果
        2.3.6 SLPI100的理化性質(zhì)、多序列比對、結(jié)構(gòu)及親疏水性
        2.3.7 SLPI100與Pin家族成員進(jìn)化關(guān)系
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 番茄lncRNA39042與SLPI100基因的表達(dá)特性及載體構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 lncRNA39042與SLPI100的組織特異性分析
        3.2.2 致病疫霉侵染下lncRNA39042與SLPI100的表達(dá)特異性分析
        3.2.3 lncRNA39042與SLPI100過表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.4 lncRNA39042的CRISPR-Cas9雙靶點(diǎn)載體的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 lncRNA39042與SLPI100基因的組織特異性
        3.3.2 致病疫霉侵染下lncRNA39042與SLPI100基因的表達(dá)特異性
        3.3.3 lncRNA39042與SLPI100的植物過表達(dá)載體
        3.3.4 lncRNA39042的CRISPR-Cas9雙靶點(diǎn)載體
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 lncRNA39042與SLPI100基因的功能分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 制備根癌農(nóng)桿菌工程菌
        4.2.2 lncRNA39042與SLPI100基因在番茄中的同源瞬時表達(dá)
        4.2.3 lncRNA39042和SLPI100基因在煙草中的異源瞬時表達(dá)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 鑒定的根癌農(nóng)桿菌工程菌
        4.3.2 lncRNA39042和SLPI100基因在番茄中的同源瞬時表達(dá)檢測
        4.3.3 lncRNA39042和SLPI100基因在番茄葉片中瞬時表達(dá)后的抗性
        4.3.4 番茄瞬時表達(dá)體系中致病疫霉處理下病程相關(guān)基因的表達(dá)特性
        4.3.5 在煙草中預(yù)測的lncRNA39042異源表達(dá)的最小自由能
        4.3.6 煙草中的異源瞬時表達(dá)特性
        4.3.7 煙草異源表達(dá)體系中致病疫霉處理下病程相關(guān)基因的表達(dá)特性
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 培養(yǎng)基配方
附錄B 論文中所用質(zhì)粒圖譜
附錄C lncRNA39042和SLPI100基因序列
附錄D 四種茄科植物蛋白酶抑制劑的序列
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝



本文編號：3791707